植物類甜蛋白基因家族研究進展

劉潮 韓利紅 王海波 高永 唐利洲

（曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心 云南省高校云貴高原動植物多樣性及生態適應性進化重點實驗室，曲靖 655011）

在整個生命周期中，植物經常暴露于不同的生物和非生物脅迫條件下，為了對抗這些環境對植物造成的不良影響，植物進化出非常復雜而多樣的防御機制［1-2］。這些防御反應包括，細胞壁加厚、抗毒素合成、病程相關基因表達等［3］。van Loon等［4］發現至少17個病程相關家族蛋白（Pathogenesisrelated protein，PR）能被卵菌、真菌、細菌、線蟲、病毒和類病毒侵染，以及昆蟲啃咬所誘導表達。植物類甜蛋白（Thaumatin-like protein，TLP）屬于第5家族，主要包括類甜蛋白、滲透蛋白（Osmotin）和Zeamatin。植物類甜蛋白因與熱帶植物西非竹竽（Thaumatococcus danielliBenth）果實中分離到的甜蛋白（thaumatin）氨基酸序列有很高的同源性而得名，兩種蛋白的同源性很高，但其功能完全不一樣，甜蛋白具有甜味無抗真菌活性，而TLP蛋白無甜味具有抗真菌活性［4］。目前，陸續從多種植物、動物及微生物中發現了TLP蛋白［5-6］。TLP基因能被多種脅迫誘導表達［7-11］，體內或體外試驗表明TLP蛋白具有抗真菌活性［12］，TLP轉基因植物對真菌性病害的耐受性和抗性明顯增強［13-21］。然而，TLP蛋白抗真菌的分子機制及其具體生物學功能還不是很清楚。因此，對植物TLP家族的研究受到越來越的關注。本文主要從TLP蛋白結構功能及應用方面綜述了最新的研究成果，以期為今后的研究提供借鑒。

1 TLP蛋白結構及其進化特征

根據蛋白分子量的大小，TLP蛋白主要分為兩種類型：L（Large）型TLP蛋白分子量介于21到26 kD，包含16個保守的半胱氨酸殘基；S（Small）型TLP蛋白分子量大約16 kD，只有10個半胱氨酸殘基［13］，雖然缺少了部分氨基酸序列，但它們仍能被病原菌誘導，并顯示出抗真菌活性［22］。Petre等［23］根據非典型區域將TLPs分為small-TLPs、TLP激酶、small-TLP激酶，這有助于預測與病原感知和病原信號有關的受體激酶。大多數TLP蛋白均具有索瑪甜家族標簽G-X-［GF］-X-C-X-T-［GA］-D-C-X-（1，2）-G-X-（2，3）-C［24］和 5 個保守的 REDDD（1個精氨酸，1個谷氨酸和3個天門冬氨酸）殘基，后者參與蛋白維持適當的拓撲結構和酸裂周圍的表面靜電勢，對TLP蛋白抗真菌活性必不可少［16］。

圖1 小果野蕉1Z3Q三維結構

典型的TLP蛋白由16個半胱氨酸殘基對形成8個二硫鍵，不僅穩定了分子結構，也保證蛋白的正確折疊，能夠抵抗熱變性、酸、堿和蛋白酶降解作用［25-26］。目前，多個TLP蛋白三維結構已被解析，顯示具有保守的酸性裂縫的3D構象。Ban-TLP（1Z3Q）由3個功能域組成：domain I為N端核心功能域，由2個反向平行的β片層（分別包含5個和6個β折疊）組成（圖1-A）；domain II由半胱氨酸二硫鍵形成的3個較短的α螺旋構成；domainⅢ由2個β折疊和1個大環構成（圖1-B）［27］。番茄TLP-NP24-Ⅰ在其結構域I和II之間有一個明顯的“V”字形裂縫，TLP-NP24-Ⅰ一級結構中構成這個裂縫的側鏈具有4個保守的氨基酸殘基Glu84、Asp97、Asp102和Asp185，在三維結構中它們均從結構域II插入到該裂縫中［28］。NP24-Ⅰ和其它具有抗真菌活性的TLP蛋白類似，其“V”字形裂縫呈酸性（帶負電）［27-28］。一些TLP蛋白含有N端信號肽，用于引導成熟的蛋白到分泌路徑。逆滲透蛋白（osmotin）和植物OLPs還具有C端前導肽，用于引導蛋白到達液泡［29］。4個擬南芥和7個水稻PR-5蛋白具有疏水結構，能結合到膜上。其他TLP蛋白具有跨膜片段和激酶結構域，可能具有感知胞外信號和信號轉導功能［30］。這些發現說明一些防御相關蛋白具有對病原和生長發育信號傳導的作用［4］。疏水性TLP蛋白和抗菌肽的“V”字形裂縫的邊緣都具有2個疏水氨基酸殘基Phe91和Phe96，而在甜蛋白的裂縫中這兩個氨基酸殘基均被被疏水性差的Tyr所取代。

有多項研究對TLP家族的進化關系進行了分析［6，13，23，31］。蛋白結構同源建模分析表明，動物和植物TLP蛋白高度相似，二者僅在表面暴露的環結構存在差異［6］。通過對昆蟲、線蟲、水稻和擬南芥TLP家族蛋白序列進化分析發現，動物TLP蛋白單獨分在一支，可能是以單一祖先序列的形式，且來自于植物；而水稻和擬南芥TLP蛋白分布于多個支系，并存在染色體內和染色體間的復制［6］。單子葉和雙子葉植物進化上發生分離后，TLP蛋白基因在10個進化枝上發生了不對稱的增加［6］。植物、動物和真菌等真核生物TLP蛋白序列進化分析顯示，陸生植物進化過程中TLP基因含量和多樣性顯著增加了［23］。對從18個植物基因組序列獲取的TLP家族基因比較發現，從萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）到毛果楊（Populus trichocarpa）TLP基因發生了多樣性的進化［23］。Liu等［13］將獲得的118個TLP蛋白序列分為9組，植物TLP蛋白主要包括5個組（Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ），他們認為TLP基因來自于大約10億年前的植物、動物和真菌的共同祖先。在有些植物中，同一染色體上甚至同一位點存在TLP基因簇，說明串聯重復是TLP超家族不對稱擴張的重要機制。

2 TLP蛋白生物學功能

2.1 抗真菌活性

近年來，TLP蛋白的抗真菌活性得到深入研究。超過20個來自動物、真菌和植物的TLP蛋白具有抗真菌活性［13］。Osmotin通過改變真菌細胞膜的透性而具有抗真菌活性［5］。植物TLP蛋白主要通過裂解真菌孢子，抑制孢子萌發，降低幼嫩菌絲活力等方式對致病和非致病真菌產生抑制作用［5，32-33］。Zeamatin通過極化活性而穿透微生物的質膜［34］。TLP蛋白的電子極化的酸性裂隙直接作用于真菌細胞膜，是其抑菌活性必需的［33，35］，TLP蛋白轉基因植物能夠延緩多種真菌病害發展過程，增強植物對病原真菌的抗性［36-37］。TLP蛋白參與多種轉基因植物對不同病原真菌的抗性。野生花生中的AdTLP重組蛋白比報道的其他TLP蛋白具有更強的抗真菌活性［17］。體外實驗表明，龍葵TLP重組蛋白對多種植物病原真菌具有抗性［38-39］。TLP蛋白的疏水部位有利于其對真菌細胞膜的作用，番茄的各種TLP蛋白中，疏水性TLP蛋白的抗真菌活性高于非疏水性TLP蛋白，具有抗真菌活性的TLP蛋白其domainI和domain II之間存在負電荷的表面裂縫［40］。但到目前為止，TLP蛋白的抗真菌機制仍不很清楚。

2.2 葡聚糖酶活性

TLP蛋白具有葡聚糖結合或葡聚糖酶活性［41-43］，TLP蛋白的葡聚糖酶活性與其抗真菌活性有關，葡聚糖酶活性使TLP蛋白能結合并降解真菌細胞壁的主要組分 β-1，3-葡聚糖［44］，為 TLP 蛋白進一步破壞真菌細胞膜奠定了基礎［45］。TLP8能結合到谷物提取物中不溶性的（1，3，1，4）-β-D葡聚糖上，有助于去除啤酒發酵中此類不需要的物質，這對啤酒發酵過程的理解和釀造工藝的改進具有重要意義［46］。模型預測發現，葡聚糖的多糖鏈與蛋白酸性裂在性狀上能很好的互補，并且Glu84與兩個Asp（Asp102、Asp97）分別位于酸性裂的兩側，因Glu84與Asp97距離太近不能進行催化反應，而Glu84與Asp102的距離又太大，也許是作為質子供體和親核劑成為內切葡聚糖酶活性所必需的催化中心［28］。一般認為，功能域I和II之間酸性氨基酸是TLP蛋白具有β-1，3-葡聚糖酶活性所必需的［27］。也有研究表明，雖然TLP家族一些蛋白具有β-1，3-葡聚糖酶活性，但活性偏低［47］。但也有些TLP蛋白并不具有 β-1，3-葡聚糖酶活性［24］。雖然 TLP 蛋白抗真菌能力可能與葡聚糖酶活性有關，但也有研究表明有些具有低的葡聚糖酶活性的TLP蛋白，不具有抗真菌能力。香蕉TLP蛋白具有可檢測的低活性的β-1，3-葡聚糖酶活性，并不具有抗真菌活性［48］。

2.3 過敏原活性

多種植物果實和花粉TLP蛋白具有過敏原活性［49］。植物來源的過敏原能引起人類Ⅰ型過敏反應，通過飲食或者上呼吸道吸入誘發。研究發現，TLP蛋白在多種水果和作物中具有過敏原活性，如獼猴桃、蘋果、櫻桃、橄欖、香蕉、番茄和小麥及柏樹的花粉等［49］。在蘋果中發現的32 kD的TLP蛋白Mal d 2具有過敏原活性［50］。在桃中發現3個TLP蛋白亞型Pru p 2.0101、Pru p 2.0201和Pru p 2.0301具有過敏原活性［51］。人心果酸性TLP基因無內含子和非糖基化，其蛋白在臨床上能引起口腔過敏綜合征，被鑒定為新的過敏原［52］。NP24屬于食品過敏類蛋白［53］，NP24-Ⅰ致敏表位（152-186）位于功能域Ⅱ的螺旋中，其含有7個Ig-E結合基序（圖2），均位于三維結構的表面［28］。這些TLP蛋白3-D結構中的功能域Ⅱ表現出非常保守的構象，預測這些氨基酸序列為主要的IgE結合表位［27］。鑒于果實和花粉中TLP致敏原的結構高度相似，可以通過蛋白結構預測設計有針對性的治療劑，對過敏原特異性免疫治療進行指導。

2.4 誘導細胞程序性死亡

細胞程序性死亡是生物體發育過程中普遍存在的，是一個由基因決定的細胞主動的有序的死亡方式。植物與病原的非親和互作過程中會伴隨著過敏反應（Hypersensitive response，HR）發生，包括宿主細胞程序性死亡（Bogrammed cell death，PCD），親和互作中也會發生PCD，其具體機制還不是很清楚［54］。植物滲透蛋白誘導了酵母菌MAPK信號通路，并通過刺激細胞壁成分的改變而增加了細胞毒性，導致滲透蛋白能夠通過細胞膜并引起細胞死亡［55］。煙草TLP蛋白通過RAS2/cAMP通路介導的胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累誘導了酵母細胞凋亡［56］，說明植物TLP蛋白具有抗菌蛋白活性。滲透蛋白誘導了目標微生物胞內積累抗菌肽，抗菌肽通過結合或破壞核酸而起作用［57］。宿主因子誘導病原PCD是宿主-病原互作的重要因素［56］。

圖2 NP24-Ig-E結合表位分布

2.5 其他活性

研究發現TLP蛋白還具有酶抑制劑活性，在植物的防御中發揮作用［26］。TLP蛋白也提高了植物對多種非生物脅迫的耐受性［32］。研究發現，植物TLP蛋白在質外體中積累，提高了植物對冷環境的適應性［58］。TLP1在桃冷害敏感品系Hermoza的細胞壁中后期積累，而在抗寒品系Oded中早期積累，TLP蛋白在核果冷害發生過程中參與了水果細胞壁結構改變，有助于水果對寒冷的抵抗［59］。TLP蛋白作為防凍劑，在控制冷凍酸奶冰晶體的形成中起作用［60］。巴西橡膠樹滲透蛋白通過提高水勢，降低植物對滲透脅迫的耐受性，參與了乳汁細胞的滲透調節［61］，滲透蛋白過表達植株通過程序性細胞死亡、細胞骨架構建以及鈣離子信號等，增強了對冷脅迫的防御能力［62］。除了冷脅迫，TLP蛋白過表達植株顯著提高了對其他多種非生物脅迫的抗性［17，63］。

TLP蛋白除了參與植物的脅迫反應之外，也參與了生長發育的多項進程。一些TLP蛋白在植物的組織器官或特定的發育階段高度表達，有些植物（如櫻桃、蘋果、香蕉）果實成熟時很多TLP蛋白高表達［64-66］。光照延長時，PpTLP轉錄增加，而幼葉中其表達很低，這可能有利于植物保護營養器官和生殖器官［16］。

3 TLP家族基因表達特征

TLP基因一般在植物特定組織、器官中低水平組成型表達，而且表達活性不同。多種高等植物遭受病原侵染時，TLP蛋白上調表達［13，67］。楊樹中TLP在細胞和組織中的定位較復雜，TLP1主要在維管系統如中脈、葉柄和莖中表達，而另一個31 kD的TLP主要在幼葉和莖的淀粉粒中表達［68］。多項研究表明TLP蛋白定位于胞外空間，能夠增強植物對多種脅迫的耐受［14，17］。定位研究顯示，病原誘導型TLP蛋白分泌到質外體中起作用［7］。

TLP基因的表達能被多種信號所調控，如水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸、受傷、紫外、滲透脅迫以及細菌、真菌、病毒等生物體的侵襲［69］。受到外界逆境脅迫后，TLP基因的表達迅速上調。TLP蛋白與植物的抗逆反應有關，當植物受到病原物（真菌、細菌和病毒等），化學因子（乙烯、水楊酸、氨基酸衍生物和重金屬離子等），物理因子（紫外線、熱處理和機械損傷等）以及特定的生理因素（衰老、開花和質壁分離等）誘導時，TLP基因在植物體特定部位迅速表達并積累。Ahmed等［70］從大白菜中鑒定了20個TLP蛋白，其中多個基因能被病原菌和非生物脅迫所誘導，說明TLP蛋白參與了大白菜對脅迫的響應。通過DNA漸滲將來自于野黃瓜的CsTLP蛋白基因構建了IL5211S系，從該系中分離到CsTLP基因，該基因響應了Pseudoperonospora cubensis和其他非生物脅迫［71］。

基因上游多樣的順式調控元件是基因特異性表達所必不可少的。TLP基因表達受啟動子區特定順式元件的調控。Rtlp1啟動子區的W-box能顯著提前其對真菌病原的響應，在真菌侵入細胞前，Rtlp1已被誘導［72］。SA處理1 h后和MeJA處理2 h后Rtlp1啟動子活性顯著增強［72］。煙草滲透蛋白啟動子區的GCC-boxes對其乙烯響應所必需［73］。啟動子中的沉默子會抑制生姜（Zingiber officinale）防御反應中ZoPR5蛋白的表達，啟動子中的GT-1 box和TGTCA可以激活植物防御反應中杧果姜CaPR5蛋白（Curcuma amada）的表達［74］。

4 TLP家簇基因的利用

傳統農業一般通過使用殺菌劑控制植物真菌病害，但農藥的廣泛應用可能導致嚴重的環境污染和食品安全問題。基因工程通過利用多種抗病基因為現代農業提供了一條可持續發展的道路。體外研究表明TLP蛋白有很強的抗真菌活性，希望能通過過表達或轉基因來提高植物對真菌的抗性。多種轉基因作物明顯提高了植物對疾病的抗性以及對干旱和鹽脅迫的耐受性。AdTLP轉基因稻煙草中，顯著增強了其對病原真菌Rhizoctonia solani的抗性，同時增強了植物對鹽和氧脅迫的耐受性［17］。將水稻的TLP基因轉入大麥（Hordeum vulgare）并過量表達，轉基因植株的抗真菌能力提高［75］。將海島棉具有次級細胞壁發育功能的類索瑪甜蛋白基因（GbTLP1）轉入煙草中，顯著增強了煙草對多種脅迫的抗性［63］。將水稻的TLP基因轉入香蕉植株中，增強了其對尖孢鐮刀菌的抗性，控制了香蕉鐮刀枯萎病的發生［15］。多數研究確實提高了植物對真菌的抗性，但卻不能對病原完全免疫，說明單個基因過量表達產生的蛋白還不足以有效保護植物完全不受病原菌的侵染。

除了PR基因本身，植物PR基因啟動子的可誘導性在植物抗病基因工程中也有極高的應用價值。植物抗病基因工程中經常將抗菌蛋白或對病原菌有毒性物質的基因置于超強啟動子控制下來提高抗病能力。但是，高度組成性表達的抗菌化合物持續在整個生育期的所有的組織中合成，對植物的生長又極為不利。而若用PR蛋白基因的啟動子控制，則轉基因只在受到病原菌侵染或其他脅迫因子處理時才表達，具有重要的利用價值。

5 結語

雖然研究者對植物TLP家族已開展了大量研究，但其抗真菌的核心機理還不是很清楚，這將大大限制該家族基因在植物遺傳育種中的應用。植物TLP家族成員眾多，在植物不同的生命進程中發揮作用的基因數量和種類還不是很清楚，這些成員在植物生長發育和對抗脅迫中的具體對應關系有待深入研究。對該家族單個基因和多個基因在植物生命進程中具體作用的深入研究，將是今后植物病理學和遺傳育種研究中的重要內容。

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