數字PCR在轉基因水稻拷貝數鑒定中的應用

王永 蘭青闊 趙新 陳銳 沈曉玲 李文 張耀中 李亮 王勤英

（1. 河北農業大學植物保護學院，河北 保定 071001；2. 天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381；3. 天津農學院，天津 300382；4. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

截止到2015年，全球共有40個國家批準轉基因作物用于糧食或飼料，涉及26種轉基因作物的363個轉基因轉化事件［1］，累計種植面積達20億hm2。伴隨轉基因技術的發展和人們生活水平的提高，轉基因作物及其衍生食品的安全問題受到社會強烈關注和爭議［2-3］。世界各個國家、組織和地區，都對轉基因作物的上市和推廣規定了明確的政策和法規［2，4］，對其開展嚴格的生物安全評價。

表達載體、目的基因整合情況、外源插入序列表達情況等分子特征是轉基因生物安全評價的重要內容，其中轉基因作物中插入外源基因的拷貝數鑒定是關鍵參數［5］。以往的拷貝數檢測方法有Southern 雜交［6］、實時熒光 PCR［7-9］、普通 PCR 方法［10］等，但在實驗步驟、標準物質要求等方面存在一定的局限性。微流滴數字PCR是新一代PCR技術，其原理是將PCR體系通過微流滴的形式分配成20 000甚至更多個微滴，經PCR擴增后進行信號閱讀獲得陽性微滴和陰性微滴的數量，再經過泊松分布的計算原理獲得樣品中靶標基因濃度。本研究應用微流滴數字PCR方法鑒定轉基因水稻目的基因拷貝數，并與Southern雜交結果進行比較，以探討微流滴數字PCR技術在轉基因作物目的基因拷貝數的應用性。

1 材料與方法

1.1 材料

轉Cry1Ab基因抗蟲轉基因水稻及其非轉基因受體由本實驗室保存。轉基因水稻具有二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟以及大螟的抗性，外源片段序列共6 600 bp，包括Ubi啟動子、Cry1Ab目的基因、T-nos終止子、T-35S部分序列等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 ddPCR試驗用DNA模板使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根，DP-320）提取，Southern 雜交用DNA模板使用CTAB大量植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊，DN1404）。1.2.2 引物篩選及設計 試驗用內標準基因、目的基因、轉化體特異性序列引物和探針序列，見表1。1.2.3 普通PCR方法 引物SPS和TJR使用普通PCR反應體系（儀器為ABI，Veriti96 PCR儀）?？?體 積 為 25 μL， 包 括 2×Gotaq Green Master Mix（Promega公司）12.5 μL，25 mg/L DNA 模板 2.0 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1.0 μL（SPS引物為 SPS-F和SPS-R各1.0 μL，TJR引物為復合體系，其中TJR-F1 2.0 μL、TJR-R1 1.0 μL、TJR-R2 1.0 μL），用ddH2O補足25 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，35次循環；72℃延伸5 min。反應結束后取出PCR管，對PCR擴增產物進行電泳檢測（2%瓊脂糖）。

表1 引物信息表

1.2.4 數字PCR方法 引物PLD和Bt使用微流滴數字PCR反應體系（儀器為Bio-Rad，QX100微流滴數字PCR儀）。總體積為20 μL，包括2×ddPCR Supermix for probes（Bio-Rad）10 μL，25 mg/L DNA模板（適當稀釋后）2.0 μL，10 μmol/L上下游引物和探針各 1.0 μL，用 ddH2O 補足 20 μL。將 20 μL 反應體系小心轉移至微滴發生卡，同時于微滴發生卡相應位置加入微滴發生專用油70 μL，蓋密封墊，放入droplet generator中生成微滴；小心吸取40 μL生成的微滴，轉移至半裙邊96孔PCR反應板中，加蓋鋁膜，置于封膜儀中170℃熱封。將熱封后的反應板放入PCR儀（Analytik Jena，EasyCycler 96 PCR儀）擴增，反應程序：95℃預變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火1 min，共進行40次循環；98℃，10 min；PCR儀升降速度設置為2℃/s。擴增結束后，將反應板放入droplet reader，根據軟件（QuantaSoft Software）提示設定參數及數據分析。

1.2.5 Southern 雜交方法 探針制備PCR擴增使用CryIA（b）引物（儀器為ABI，Veriti96 PCR儀）?？傮w積為50 μL，包括2×Gotaq Master Mix（Promega公司）25 μL，25 mg/L DNA 模板 4.0 μL，10 μmol/L上下游引物各2.0 μL，用ddH2O補足50 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，共進行35次循環；72℃延伸5 min。反應結束后取出PCR管，對PCR擴增產物進行電泳檢測（1%瓊脂糖）及地高辛探針制備（Roche公司）?；蚪MDNA模板酶切體系總體積為 800 μL，包括 10×Buffer 80 μL，內切酶 40 μL，基因組DNA 10 μg。探針和酶切產物經電泳、轉膜、雜交等后續步驟獲得Southern 雜交結果。

2 結果

2.1 數字PCR方法結果

2.1.1 DNA提取結果分析 分別準備轉基因水稻及其受體材料各4份，取單粒進行萌發，采用試劑盒法提取基因組DNA，使用NanoDrop ND-1000微量分光光度計測量DNA濃度、A260/A280、A260/A230等指標。結果表明（表2），提取的DNA濃度在96.8-123.5之間，A260/A280均在1.8-2.0之間，說明純度較高。

表2 DNA濃度和純度檢測結果

對提取的基因組DNA進行水稻內標準SPS基因的PCR擴增，電泳結果（圖1）顯示，8個水稻材料均擴增出277 bp大小的預期片段，條帶清晰單一，說明提取的基因組DNA滿足PCR的要求。

圖1 SPS基因PCR擴增結果

2.1.2 轉基因水稻純合性鑒定分析 在進行數字PCR鑒定拷貝數之前，需對材料進行純合性鑒定。依據轉化體特異性序列信息，設計純合性鑒定復合PCR引物TJR（表1）。其中TJR-F1/R1靶標為水稻基因組序列，TJR-F1/R2靶標為轉基因水稻轉化體特異性序列；純合陰性材料僅能擴增出376 bp大小的TJR-F1/R1擴增產物，純合陽性材料僅能擴增出741 bp 大小的TJR-F1/R2擴增產物，雜合材料能擴增出TJR-F1/R1和TJR-F1/R2兩種擴增產物。復合PCR結果顯示，本試驗選擇的轉基因水稻陰性和陽性材料均為純合材料（圖2）。

圖2 轉基因水稻純合度鑒定結果

2.1.3 微流滴數字PCR鑒定插入拷貝數分析 以4份轉基因水稻基因組DNA為模板，應用微流滴數字PCR技術擴增內標準基因PLD和目的基因Cry1Ab。結果顯示，生成微滴總數量在13 000-16 000之間（圖3）；陽性微滴和陽性微滴熒光信號分離界限明顯（圖4）；4個重復的測得目的/內標準基因的比值分別為674/662、516/541、737/759、528/571（圖 5），均值為0.97≈1。本試驗采用的內標準基因的拷貝數為1，試驗材料經驗證為純合材料，因此確定目的外源基因Cry1Ab在該轉基因水稻品系中的拷貝數為1。

圖3 微流滴數字PCR微滴數量結果

圖4 微流滴數字PCR微滴熒光信號

圖5 微流滴數字PCR測定PLD和Cry1Ab拷貝數濃度結果圖

2.2 Southern雜交結果

根據外源插入序列全長及探針序列信息，篩選出無酶切位點的限制性內切酶共39種（表3）；選擇其中NcoI、SphI、SacI、BamH I、Hind III、PstI和MseI共7種內切酶用于Southern雜交試驗（表3中底紋標識）。

應用上述7種內切酶，對轉基因水稻基因組DNA酶切，結果見圖6。從圖中可見，酶切后泳道呈彌散狀，無明顯條帶，說明基因組DNA酶切效果較好。用引物Cry1Ab擴增產物為雜交探針，對酶切產物進行Southern-blotting試驗。雜交結果（圖7）顯示，轉基因水稻基因組DNA經7種內切酶酶切后，探針雜交信號均為1個，說明目的基因的拷貝數為1。

3 討論

Southern雜交是最經典的外源基因拷貝數鑒定的技術［11］，依據靶標探針與酶切基因組DNA雜交信號的數量對外源基因的拷貝數進行鑒定，試驗步驟包括探針制備、基因組DNA酶切、轉膜、雜交等。燕樹鋒等［12］應用Southern雜交方法鑒定了轉CrylAc-w基因抗蟲玉米目的基因的插入位點。Southern雜交技術具有靈敏度高、無需已知拷貝數的內標準基因等優點，現在仍然被眾多實驗室應用。但同時，由于整個操作流程較費事費力且需要大量的DNA模板，因此近年來該技術應用范圍越來越小，逐步被其他技術取代。

表3 轉基因抗蟲水稻Cry1Ab探針候選限制性內切酶

圖6 轉基因抗蟲水稻酶切結果

圖7 轉基因抗蟲水稻Southern雜交結果圖

宋鋒等［10］以轉基因煙草植株為對象，針對已知單拷貝的煙草內標準基因RNR2和待測拷貝數外源基因NPTⅡ設計了相同退火溫度的PCR引物，通過軟件計算復合定性PCR的電泳產物的灰度比，確定了7株不同轉基因煙草中外源基因NPTⅡ的拷貝數。該方法具有過程簡單、高效、成本低的技術優點，但同時對引物退火溫度、擴增效率、PCR產物大小等提出嚴格條件，以避免在成像過程中造成誤差。

實時熒光PCR技術被應用于小麥、棉花、水稻、大豆和玉米等轉基因作物外源基因拷貝數鑒定。楊曉杰等［13］基于SYBR Green定量PCR技術的PfaffI法，比較了農桿菌介導法、基因槍轟擊法和花粉管通道法等3種常用轉化方法獲得的轉基因棉花中外源基因拷貝數的差異，結果表明實時熒光PCR方法滿足高通量地檢測大規模轉化體轉基因拷貝數；李淑潔等［9］采用SYBR Green real time PCR方法檢測7株轉基因小麥中外源半夏凝集素基因的拷貝鑒定出單拷貝、2拷貝、3拷貝和4拷貝植株；王育花等［14］利用SYBR Green I熒光定量實時PCR 法檢測了轉大麥煙酰胺合成酶基因水稻中外源基因拷貝數，鑒定出1、2、3、4和7個拷貝；楊冬燕等［15］利用TaqMan定量PCR技術鑒定了轉基因大豆RRS和轉基因玉米Bt176中外源基因拷貝數，結果為Bt176玉米中CrylA（b）基因的整合拷貝數分別為2.69，3.43和2.83，平均為2.9，RRS大豆中EPSPS基因拷貝數分別為1.08、1.01和0.96，平均為1.0。上述方法表明實時熒光PCR方法具有較強的適用性和外源插入拷貝數分辨率。但是該技術必須使用標準物質（或標準質粒）繪制標準曲線，對靶標基因和已知拷貝數的內標準基因進行濃度測定。

微流滴數字PCR是繼定性PCR、實時熒光PCR之后的第三代PCR技術。微流滴數字PCR技術具有絕對定量、無需構建標準曲線等技術特點，已應用于轉基因產品成分精準定量等研究中［16-18］。本研究應用這一技術對轉基因水稻內標準基因PLD（在水稻基因組中為單拷貝［19-20］）和目的基因Cry1Ab濃度進行絕對定量檢測，通過計算Cry1Ab/PLD，獲得轉基因水稻目的基因Cry1Ab的插入拷貝數［21-22］。與普通PCR和實時熒光PCR方法相比，微流滴數字PCR無需通過構建標準曲線來定量靶標基因和內標準基因的拷貝數濃度，因此適用性更強。

4 結論

本研究應用微流滴數字PCR技術鑒定轉基因抗蟲水稻中外源目的基因Cry1Ab在基因組的插入拷貝數。對4個轉基因純合單株進行檢測，結果分別1.02、0.95、0.97、0.92，因此鑒定為單拷貝插入。該結果與經典方法Southern雜交鑒定結果一致。

［1］ James C.Brief 51：20th Anniversary（1996 to 2015）of the Global Commercialization of Biotech Crops and Biotech Crop Highlights in 2015［M］. Ithaca, NY, USA：ISAAA, 2015.

［2］ Goodman RE. Biosafety：evaluation and regulation of genetically modified（GM）crops in the United States［J］. Journal of Huazhong Agricultural University, 2014, 33（6）. 109-114.

［3］ Sanvido O, Romeis J, Gathmann A, et al. Evaluating environmental risks of genetically modified crops：ecological harm criteria for regulatory decision-making［J］. Environmental Science & Policy,2012, 15（1）：82-91.

［4］ Zepeda J, Cohen J. Biosafety regulation of genetically modified orphan crops in developing countries：A way forward［M］//regulating agricultural biotechnology：Economics and policy, US Springer, 2006：509-533.

［5］ 農業部辦公廳. 農業轉基因生物安全評價指南［S］：北京：2017.

［6］ 華志華, 等. 基因槍轉化獲得的轉基因水稻中外源基因整合與表達規律研究［J］. 遺傳學報, 2001, 28（11）：1012-1018.

［7］ 楊立桃, 等. 利用實時熒光定量 PCR 方法分析轉基因水稻外源基因拷貝數［J］. 中國食品衛生雜志, 2005（2）：140-144.

［8］ 孔慶然, 等. 轉基因豬中外源基因拷貝數和整合位點的研究［J］.生物化學與生物物理進展, 2009（12）：1617-1625.

［9］ 李淑潔, 張正英. REAL-TIME PCR 方法測定轉基因小麥中外源基因拷貝數［J］. 中國生物工程雜志, 2010, 30（3）：90-94.

［10］ 宋鋒, 孫敏, 羅克明. 一種基于 PCR 技術鑒定單拷貝轉基因煙草的方法［J］. 中國生物工程雜志, 2010, 30（4）：83-88.

［11］ 羅濱, 陳永康, 王瑩. 植物外源基因拷貝數及插入位點的檢測方法與技術［J］. 河南師范大學學報：自然科學版, 2012, 40（6）：111-116.

［12］ 燕樹鋒, 鐵雙貴, 岳潤清, 等. 轉 Cry1Ac-w 基因抗蟲玉米的獲得及分子鑒定［J］. 華北農學報, 2015（5）：41-44.

［13］ 楊曉杰, 劉傳亮, 張朝軍, 等. 不同轉化方法獲得的轉基因棉花外源基因拷貝數分析［J］. 農業生物技術學報, 2011, 19（2）：221-229.

［14］ 王育花, 等. 利用實時熒光定量 PCR 法檢測轉基因水稻外源基因拷貝數的研究［J］. 生命科學研究, 2007（4）：301-305.

［15］ 楊冬燕 , 郭良讓 , 楊小柯 , 等 . 利用 TaqMan 定量 PCR 技術不依賴參比內源基因測定轉基因植物外源基因拷貝數［J］. 中國衛生檢驗雜志, 2008, 18（6）：992-996.

［16］ Dobnik D, Spilsberg B, Bogo?alec Ko?ir A, et al. Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction［J］. Analytical Chemistry, 2015, 87（16）：8218-8226.

［17］ Gerdes L, Iwobi A, Busch U, et al. Optimization of digital droplet polymerase chain reaction for quantification of genetically modified organisms［J］. Biomol Detect Quantif, 2016, 7 ：9-20.

［18］ Zhu P, Wang C, Huang K, et al. A novel pretreatment-free duplex chamber digital PCR detection system for the absolute quantitation of GMO samples［J］. Int J Mol Sci, 2016, 17（3）：402.

［19］ Wang C, Jiang L, Rao J, et al. Evaluation of four genes in rice for their suitability as endogenous reference standards in quantitative PCR［J］. J Agric Food Chem, 2010, 58（22）：11543-11547.

［20］ Wu G, Wu Y, Nie S, et al. Real-time PCR method for detection of the transgenic rice event TT51-1［J］. Food Chemistry, 2010, 119（1）：417-422.

［21］ Dalmira FU, Melina PU, José-Benigno VT, et al. Development,optimization, and evaluation of a duplex droplet digital PCR assay to quantify the T-nos/hmg copy number ratio in genetically modified maize［J］. Analytical Chemistry, 2015, 88（1）：812-819.

［22］ Jiang Y, Hu JY, Yang LT. Estimating the exogenous genes copy number of genetically modified organisms by droplet digital PCR［J］. J Agric Biotechnol, 2014, 22（10）：1298-1305.