銅綠假單胞菌檢測方法的比較與優化

張帆 李樹垚 張子豪 蔡雪鳳 任巖 劉凱 侯翠艷易欣欣 高秀芝

（1. 北京農學院食品科學與工程學院 農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室 食品質量與安全北京實驗室 微生態制劑關鍵技術開發北京市工程實驗室，北京 102206；2. 國家食品質量安全監督檢驗中心，北京 100094）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，革蘭氏陰性菌，是一種重要的水源和食源性致病菌［1］，廣泛分布在自然界中，如水、土壤及空氣中均有存在，能引起傷口、呼吸道以及泌尿道感染，甚至會引起敗血癥［2-3］。銅綠假單胞菌耐藥能力強，在治療時往往需要使用多種抗生素進行聯合用藥，但也不能保證將其完全根除。因此，如何快速而準確地鑒定出銅綠假單胞菌對保障食品安全具有重要的意義［4-9］。據世界衛生組織（WHO）統計，人類 70%-80%的疾病都來源于不潔凈的飲用水［10-11］。瓶裝礦泉水中銅綠假單胞菌污染情況分析日漸受到重視。近年來，國內外均有在水源水或成品水中檢出銅綠假單胞菌的報道［10，12-17］，甚至多批次樣品的銅綠假單胞菌檢出率大于 10%［11］。

目前，國家標準GB 8538-2016天然礦泉水檢驗方法和GB/T7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法中分別規定了礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗方法和化妝品種銅綠假單胞菌的檢驗方法［18-19］。VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統用于微生物鑒定的準確率高，可用于微生物實驗室的日常檢測工作［20-21］。但根據日常檢驗工作經驗，按照GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗方法分離得到的部分陽性菌株，采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行鑒定后為假陽性或假陰性。按照GB/T7918.4-1987化妝品微生物標準銅綠假單胞菌檢驗方法進行檢驗，同樣會出現錯誤檢驗結果。

本實驗以VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統鑒定結果為參考，對GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢測方法和GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法中綠膿桿菌的檢測方法進行分析與比較，研究并優化現行國家標準 GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌的檢驗方法，旨在提高日常樣品檢測的準確度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 （1）標準菌株：銅綠假單胞菌ATCC 27853（BZ-33）與殺鮭氣單胞菌CICC 23564（BZ-34）為中國工業微生物菌種保藏中心保藏菌種，支氣管炎博德特菌CGMCC 1.2418（BZ-38）、熒光假單胞菌CGMCC 1.0867（BZ-41），以及惡臭假單胞菌CGMCC 1.2309（BZ-42）為中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏菌種，其中銅綠假單胞菌作為陽性對照，其余菌株為陰性對照。（2）實驗室保藏菌株：YP-129、YP-131、YP-132、YP-141、YP-143、YP-170、YP-171、YP-190、YP-249、YP-250、YP-251、YP-252、YP-253、YP-254、YP-255、YP-256、YP-257、YP-258、YP-259、YP-260、YP-261 及 YP-269，22株實驗室保藏菌株均分離自礦泉水，保藏菌種前初次乙酰胺試驗結果均為陽性。

1.1.2 主要試劑及耗材 假單胞菌瓊脂基礎培養基（CN瓊脂）、營養瓊脂斜面培養基、血瓊脂平板、SCDLP液體培養基、十六烷三甲基溴化銨培養基、綠膿菌色素測定用培養基、金氏B培養基（King’s B）、明膠培養基、乙酰胺肉湯、氧化酶試劑、鈉氏試劑、革蘭氏染色液、生理鹽水（0.45% NaCl和0.85%NaCl）等，以上試劑購買自北京陸橋技術有限公司。GN TEST 革蘭氏陰性桿菌鑒定卡與GP TEST 革蘭氏陽性桿菌鑒定卡購于北京威泰科生物技術有限公司、0.45 μm濾膜購于PEEL CORNER公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 將-80℃凍存的5株標準菌株與22株實驗菌株劃線接種于營養瓊脂斜面上，36℃培養24 h，連續傳代2-3次，得到活化菌株。

1.2.2 梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統鑒定方法 （1）把活化好的菌株接種至血瓊脂平板，36℃培養18 h，有刺激性味道、多數有溶血現象、邊緣不整齊的墨綠色菌落或者扁圓形灰白色菌落為可疑菌落；（2）將可疑菌落進行革蘭氏染色，普通光學顯微鏡下觀察染色結果與菌體形態，根據結果準備相應的鑒定卡類型；（3）用無菌棉拭子挑取血平板上活性良好的待測菌落，將3 mL 0.45% NaCl溶液加入一次性懸浮液管，用生理鹽水調配至麥氏濃度0.6左右，在真空填充艙內填充至革蘭氏陰性桿菌鑒定卡或革蘭氏陽性桿菌鑒定卡，采用梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統鑒定。

1.2.3 GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗方法 （1）將1.2.1得到的活化菌株與礦泉水混勻制備102CFU/mL待測水樣（因為人工污染水樣，菌濃高于實際樣品，省略掉GB 8538-2016中水樣過濾操作）。（2）吸取1 mL 待測水樣至無菌平皿中，與冷卻好的CN瓊脂培養基混勻，（36±1）℃培養。（3）培養24 h和48 h后觀察菌落的生長情況。計數所有顯藍色或綠色（綠膿菌素）疑似銅綠假單胞菌的菌落，并進行綠膿菌素確證性試驗。在紫外線下檢查所有發光不產綠膿菌素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進行乙酰胺肉湯確證試驗。將其它所有紅褐色不發熒光的菌落進行氧化酶測試、乙酰胺液體培養基、金氏B培養基確證性試驗。（4）確證性試驗：營養瓊脂；氧化酶試驗；金氏B培養基；綠膿菌素試驗；乙酰胺液體培養基產氨試驗［18］。

1.2.4 GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法 （1）取1 mL的1.2.3待測水樣接種到體積為99 mL的SCDLP液體培養基中（因人工污染樣品，加樣體積區別于GB/T7918.4-1987），置于36℃下進行培養24 h；觀察培養液顏色是否為黃綠色或藍綠色以及培養液的表面是否有一層薄薄的菌膜；（2）挑取一環培養物，劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，（36±1）℃培養24 h；（3）在非選擇性培養基上挑取活性良好的可疑菌落進行涂片，并進行革蘭氏染色，革蘭氏陰性菌的可疑菌落需進行氧化酶實驗；（4）氧化酶試驗；（5）綠膿菌素試驗操作；（6）硝酸鹽還原產氣試驗；（7）明膠液化試驗；（8）42℃生長試驗［19］。

1.2.5 對GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌檢測方法的優化 結合幾種方法的測定原理與結果對GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌檢測方法進行優化，并且應用優化后的方法對27株試驗菌株進行驗證試驗。

2 結果

2.1 梅里埃VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統鑒定結果

5株標準菌株與22株實驗室保藏菌株經革蘭氏染色，結果全部為陰性，采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統鑒定結果如表1所示。VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統對5株標準菌株的鑒定結果符合率為100%，其中BZ-33為銅綠假單胞菌（Ps. Aeruginosa，94%），其余22株保藏菌株中YP-141（98%）、YP-170（97%）、YP-190（97%）、YP-249（99%）以及YP-258（97%）鑒定為銅綠假單胞菌，全部27株菌株中陽性菌株為6株，檢出率為22.2%。陰性菌株為21株。以VITEK 2 Compact對所有標準菌株和試驗菌株的鑒定結果作為其它兩種檢驗方法檢驗結果的參考。

2.2 GB 8538.57-2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗結果

以VITEK 2 Compact鑒定結果作為檢驗結果的參考，27株試驗菌株采用GB 8538.57- 2016天然礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗，檢驗結果如表2所示，12株菌檢測為銅綠假單胞菌陽性，陽性檢出率為44.4%。假陽性的菌有8株，分別是BZ-38、BZ-42、YP-132、YP-250、YP-253、YP-254、YP-256、YP-259，假陽性檢出率為29.6%。假陰性的菌株有2株，YP-141和YP-249，假陰性的檢出率為7.4%。結果表明GB 8538.57-2016中銅綠假單胞菌的檢驗方法對銅綠假單胞菌檢驗結果的準確率較低。

2.3 GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法中綠膿桿菌檢驗結果

27株試驗菌株采用GB/T 7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法綠膿桿菌（銅綠假單胞菌）檢驗，結果如表3所示，陽性檢出率為26%。假陽性的菌株有2株，YP-171和YP-260。假陰性的菌株有1株，YP-141。假陽性的檢出率為7.4%。假陰性的檢出率為3.7%。結果表明GB/T 7918.4-1987檢驗方法對銅綠假單胞菌檢驗結果的準確度存在一定的誤差，但是檢驗準確率高于GB 8538.57-2016方法。

2.4 對銅綠假單胞菌檢驗方法的改進

綜合3種對銅綠假單胞菌的檢驗程序與相應的檢驗結果，對其檢驗方法進行適當改進，以GB 8538. 57-2016礦泉水中銅綠假單胞菌檢測方法為例，改進后的檢驗程序如圖1所示。檢驗程序中主要增加了3步：（1）將CN平板上生長出的藍綠色菌落、360 nm紫外燈下產熒光（非藍綠）菌落，轉接到血瓊脂平板36±1℃培養24-48 h并計數；（2）將可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，銅綠假單胞菌為革蘭氏陰性桿菌；（3）對血平板所有可疑菌落進行綠膿菌素試驗。結果判定時菌體同時滿足革蘭氏陰性桿菌、氧化酶陽性、乙酰胺產氨陽性及綠膿菌素陽性，判定為銅綠假單胞菌陽性，其余反應為陰性。

表1 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統對試驗菌株的鑒定結果

2.5 改進銅綠假單胞菌檢測方法的驗證試驗

采用改進后的GB 8538. 57-2016礦泉水中銅綠假單胞菌檢測方法對27株試驗菌株進行驗證試驗，試驗結果如表4所示，改進后的方法結果判定BZ-33、YP-141、YP-170、YP-190、YP-249及 YP-258為銅綠假單胞菌陽性，全部27株菌株中陽性菌株為6株，檢出率為22.2%，與VITEK 2 Compact的鑒定結果完全一致。

3 討論

VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定儀（包括藥敏測試）是法國生物梅里埃公司推出的智能系統。適合用于微生物實驗室的日常檢測工作。該系統能簡化日常復雜的生化實驗操作，曾寫進中華人民共和國國家標準GB/T4789-2016中，如GB/T4789.4-2016沙門氏菌中的生化鑒定［22］。孫燕萍等［23］采用VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統儀對無錫市常見 12 種224株食源性致病微生物的鑒定結果與 API 鑒定系統鑒定結果的總體符合率為99.6%（223/224）；何艷霞等［24］采用 16S rRNA 和 rpoB 基因序列分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應用，用表型分類方法對VITEK自動微生物鑒定系統鑒定為銅綠假單胞菌的23 株分離株進行再鑒定，結果表明表型再鑒定結果與自動微生物鑒定系統鑒定結果一致。宋逸萍等［25］研究發現VITEK 2 Compact對銅綠假單胞菌鑒定準確率在98%以上。但條件一般的檢測機構，尤其偏遠地區的不具備VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定儀，采用其對樣品鑒定的試驗條件要求較高。基于VITEK 2 Compact的鑒定結果準確度高的原因，本實驗選用VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定儀鑒定結果作為其它檢測方法的結果參照標準。

表2 GB 8538.57-2016對27株試驗菌株的檢驗結果

用GB 8538.57-2016礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗方法的檢測結果中與VITEK 2 Compact結果相比，假陽性的檢出率為29.6%，分析原因是這8株菌在CN培養基上生長出黃色菌落，是產熒光（非藍綠色）的菌落并且乙酰胺實驗結果為陽性，依標準被判定為陽性檢出銅綠假單胞菌。假陰性的檢出率為7%，分別是YP-141和YP-249。一般陽性菌株的熒光多為綠色或黃色，與綠膿菌素的顏色相近。YP-249的菌株實驗結果表現異常，分析為該菌為藍綠色菌落并且綠膿菌素實驗陰性，被判定為陰性未檢出銅綠假單胞菌，然而乙酰胺試驗和氧化酶試驗均為陽性，符合銅綠假單胞菌的生化特性。因此，單純根據GB 8538.57-2016中所設計的生化實驗判定銅綠假單胞菌檢驗結果明顯準確度不高。另外，所有參與試驗的菌株在CN上的菌落顏色均無紅褐色，故實驗沒有進行接種金氏B瓊脂培養基的步驟，金氏B 產熒光實驗是不是判定陽性結果的必要條件，這一結論還需要實驗的進一步驗證。

綜上所述，CN瓊脂培養基上生長出藍（綠）菌落加綠膿菌素試驗和CN瓊脂培養基上生長出的黃色產熒光菌落加乙酰胺試驗的生化特性并不足以保證其結果的準確性。因此，標準GB 8538-2016中的試驗方法是不嚴謹的，需要設計相應的補充生化實驗進行驗證。

表3 GB/T 7918.4-1987對27株試驗菌株的檢驗結果

采用GB/T 7918.4-1987中銅綠假單胞菌的檢驗結果中假陽性的菌株有2株，YP-171和YP-260，假陰性的菌株有1株，YP-141。十六烷三甲基溴化銨是標準中所規定的作為化妝品受測試樣品增菌后的篩選分離培養基。實驗是用實驗室保藏的純菌種進行檢測，菌株增菌之后，劃線于十六烷三甲基溴化胺瓊脂，經培養觀察，即便是標準菌株BZ-33在此培養基上生長狀況不是很好。而此法的假陽性檢測數量明顯低于GB 8538.57-2016，分析原因為十六烷三甲基溴化胺瓊脂選擇性較強，同樣因此出現了假陰性結果。

基于GB 8538.57-2016和GB/T 7918.4-1987檢測方法的程序與實驗判定不足，以GB 8538.57-2016天然礦泉水檢驗方法中銅綠假單胞菌檢測方法為例，改進了檢測方法，改進后的檢測方法避免了單純某種生化反應造成的結果誤判，對27株試驗菌株進行鑒定與鑒定儀的結果完全相符。產品檢驗方法的準確性對企業和消費者都尤為重要。國家食品質量安全監督檢驗中心每年檢驗工作量巨大，2015年GB 19298-2014包裝飲用水國家標準實施后，以往不需要做銅綠假單胞菌的純凈水、蒸餾水等樣品也需要做5份銅綠假單胞菌的檢驗［26］。2016年本檢驗中心的礦泉水樣品檢測量約300份，樣品總檢測量約2 000份。2016年陽性檢出率約為5%，用改進后方法檢出率降低到3%。改進后的GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌檢測方法結果判定依據更嚴謹，結果更準確、試驗條件要求低、相對操作簡單易行。當然，這一方法還需要后續大量的檢測試驗去驗證其可行性與準確性。

圖1 改進后的礦泉水中銅綠假單胞菌檢驗程序

4 結論

本研究改進了GB 8538.57-2016銅綠假單胞菌的檢測方法，改進后的方法增加了血瓊脂平板培養、革蘭氏染色及鏡檢和對血平板所有可疑菌落進行綠膿菌素試驗。用改進后的GB 8538-2016銅綠假單胞菌檢測方法對27株試驗菌株進行驗證試驗，檢驗結果與VITEK 2 Compact一致。

表4 改進后銅綠假單胞菌檢驗方法的驗證試驗

［1］聞玉梅. 現代醫學微生物學［M］. 上海：上海醫科大學出版社,1999.

［2］ Murray PR. Manual of clinical microbiology［M］. 9thed, Washington DC：American Society for Microbiology, 2007：1762-1766.

［3］何艷霞, 向詩非, 李 澆. 基于16S rRNA 和 rpoB 基因的分子系統發育分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應用［J］. 微生物學雜志,2016, 36（4）：27-35.

［4］ Zamberlan da Silva ME, Santana RG, Guilhermetti M, et al. Comparison of the bacteriological quality of tap water and bottled mineral water［J］. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2008, 211（5-6）：504-509.

［5］Varga L. Bacteriological quality of bottled natural mineral waters commercialized inhungary［J］. Food Control, 2011, 22（3-4）：591-595.

［6］龍春平, 吳周健, 周秀萍. 2001-2002年吉首市桶裝飲用水衛生微生物學分析［J］. 實用預防醫學, 2004, 11（1）：140-141.

［7］武景福, 王文委, 武和平. 三門峽市區2002-2006年生活飲用水微生物學指標監測結果分析［J］. 中國預防醫學雜志, 2008,9（4）：298-300.

［8］周黎, 朱玫, 陳依江, 等. 生活飲用水和水源水微生物檢測結果分析［J］. 應用預防醫學, 2011, 17（2）：102-104.

［9］ 張輝, 吳陳, 劉懷志, 等. 德陽市飲用水微生物污染情況調查［J］. 環境衛生學雜, 2011, 1（6）：23-25.

［10］魏磊, 吳清平, 張菊梅, 等. 礦泉水和山泉水中銅綠假單胞菌污染調查及分離菌株毒力基因與耐藥性分析［J］. 微生物學通報 , 2015, 42（1）：125-132.

［11］鄧梅清, 張菊梅, 郭偉鵬, 等. 礦泉水中銅綠假單胞菌污染狀況調查研究［J］. 中國衛生檢驗雜志, 2009, 19（11）：2672-2673.

［12］馬群飛, 陳偉偉, 楊毓環, 等. 瓶裝飲用純凈水銅綠假單胞菌污染情況調查［J］. 食品科學, 2000, 21（2）：50-53.

［13］Nagaveni S, Rajeshwari H, Oli AK, et al. Widespread emergence of multidrug resistantPseudomonas aeruginosaisolated from CSF samples［J］. Indian Journal of Microbiology, 2011, 51（1）：2-7.

［14］Fuentefria DB, Ferreira AE, Cor??o G. Antibiotic-resistantPseudomonas aeruginosafrom hospital wastewater and superficial water：Are they genetically related ？［J］. Journal of Environmental Management, 2011, 92（1）：250-255.

［15］張永清, 吳清平, 彭飛艇, 等. 礦泉水中銅綠假單胞菌及溴酸鹽污染情況分析［J］. 食品與生物技術學報, 2012, 31（10）：1046-1050.

［16］潘虹, 楊臣, 魏曉雪, 等. 五大連池天然礦泉水水源微生物污染調查［J］. 中國衛生檢驗雜志, 2012, 22（8）：1946-1949.

［17］王爽, 侯配斌, 劉靜, 等. 山東省 2014 年礦泉水中微生物檢測及銅綠假單胞菌分離株脈沖場凝膠電泳分型［J］. 中國衛生檢驗雜志, 2015, 25（23）：4104-4105.

［18］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局. 中國國家標準化管理委員會. GB 8538-2016天然礦泉水檢驗方法. ［S］. 北京：中國標準出版社, 2016.

［19］中國預防醫學科學院環境衛生監測所. 化妝品微生物標準檢驗方法綠膿桿菌［S］. GB/T7918. 4-87. 北京：中國標準出版社,1987.

［20］楊晶, 王偉歡. VITEK 2 Compact 系統的應用及鑒定結果分析［J］. 中國衛生檢驗雜志, 2016, 26（18）：2643-2645.

［21］喬寧, 喻華, 殷琳, 等. VITEK 2 COMPACT 全自動微生物分析儀性能分析［J］. 淮海醫藥, 2012, 30（3）：211-213.

［22］中華人民共和國衛生部. 中國國家標準化管理委員會. 食品衛生微生物學檢驗沙門氏菌檢驗［S］. GB4789. 4-2016. 北京：中國標準出版社, 2016.

［23］孫燕萍, 彭浩, 凌霞, 等. VITEK 2 Compact 全自動微生物分析系統的應用及鑒定結果分析［J］. 現代預防醫學, 2010, 37（20）：3891-3893.

［24］何艷霞, 向詩非, 李澆, 等. 基于16S rNA 和rpoB 基因的分子系統發育分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應用［J］. 微生物學雜志 , 2016, 36（4）：27-35.

［25］宋逸萍, 宛傳丹, 馬月琴, 等. VITEK 2 Compact 高級專家系統對腸桿菌科及銅綠假單胞菌中β-內酰胺酶耐藥表型鑒別能力分析［J］. 江蘇大學學報, 2012, 22（1）：77-79.

［26］ 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. GB 19298-2014包裝飲用水. ［S］. 北京：中國標準出版社, 2014.