外源茉莉酸甲酯對小麥幼苗低溫耐受性的影響

李楊洋 焦湞

（鄭州大學離子束生物工程省重點實驗室，鄭州 450052）

冬小麥以及半冬性小麥多種植于我國華北及華中地區，低溫馴化是小麥順利進入越冬期的關鍵。據中國氣象局統計，2016年11月中旬至12月中旬，河南省平均高溫11℃，平均低溫2℃，最低溫度達-5℃，而2015年11月中旬至12月中旬，河南省省平均高溫7℃，平均低溫1℃，最低溫度-7℃。2015年-2016年冬季北方冬麥區大部分平均氣溫接近常年同期或偏高1-2℃，但氣溫起伏較大，先后遭受4次強寒潮等極端天氣過程襲擊，冬小麥入冬早，冬前生長不足，個體偏弱［1］。小麥在經過極端天氣襲擊后，提前入冬，引發初冬凍害，不利于小麥后期生長發育。因此，增強小麥低溫脅迫的耐受能力具有重要意義。

高等植物體內生理生化水平可有效反映植物受冷凍害程度，在此過程中，一些抗氧化酶如超 氧 化 物 歧 化 酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）能有效清除細胞內過多的自由基和活性氧，達到抗寒或緩解傷害的效果［2］。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂膜過氧化作用產物之一，對機體有毒害作用，MDA大量積累會造成膜透性增大，電解質外滲，使細胞膜受到損傷［3］。植物細胞中游離脯氨酸有極強的親水性，能夠防止細胞水分流失、降低冰點，穩定細胞原生質體和代謝活動［4］。可溶性蛋白作為植物細胞中酶的重要組成成分，參與多種細胞生命代謝活動，是植物細胞內重要的滲透調節物質，也是植物冷凍害指標之一［3］。

CBF（C-repeat binding factors）是一類冷調控轉錄因子，隸屬于AP2/EREBP轉錄因子家族，對調節植物低溫耐受性有重要作用。已有研究表明，CBF冷調控轉錄因子通過ICE-CBF-COR通路對植物低溫耐受起到了重要作用［5］。當植物體受到低溫脅迫后，CBF轉錄激活因子（Inducer of CBF expression ICE）誘導CBF表達［6］，而后CBF與下游冷調控基因（Cold-regulated gene COR） 中 的 CRT（C-repeat element CRT/DRE）元件結合，誘導COR下游基因的表達［7］，從而提高植物低溫耐受能力。CRT/DRE原件含有CCGAC核心序列（Low temperatureresponsive element，LTRE），該序列普遍存在于冷誘導和脫水誘導基因的啟動子中，為這類基因的誘導表達所必需［8］。因此，CBF基因家族的表達是植物在分子水平抗寒機制的關鍵途徑之一［9］。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是一種茉莉酸（Jasmonic acid，JA）類似物，廣泛存在于高等植物體內，是天然合成的新型生長調節物質［10］。經研究，MeJA在植物生長發育中起著重要的作用，可抑制花粉粒萌發、促進葉片衰老、果實成熟、誘導塊莖形成、誘導卷須卷曲以及促進葉片氣孔關閉［11-12］。內源茉莉酸類物質在植物受到傷害脅迫時，會與其他內源信號分子如水楊酸、脫落酸、乙烯等誘導相關抗逆基因的表達。因此，外源MeJA的噴施有望成為提高小麥抗寒能力的新途徑［13］。

本研究以華北及華中地區種植較廣的矮抗58小麥品種為材料，分別經過雙蒸水與外源MeJA噴施小麥幼苗后，測定小麥在冷馴化條件下的成活率、抗氧化酶活性、MDA含量、脯氨酸及可溶性蛋白含量，并結合實時熒光定量PCR技術分析抗寒應答因子TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19在冷馴化條件下的表達量，以探究外源MeJA對小麥對低溫脅迫抵抗能力的調控效應，從而為提高小麥在冷馴化條件下的抗寒能力提供一種可行性技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥品種為矮抗58，由鄭州大學離子束實驗室提供。MeJA飽和溶液購于上海瑞永生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外源MeJA噴施和冷馴化處理 實驗設兩組小麥幼苗：雙蒸水低溫處理（對照組）和外源MeJA噴施低溫處理（實驗組），每組50株小麥幼苗，每組設3組重復，小麥種子經0.1%HgCl2表面消毒15 min，蒸餾水清洗3次，浸種24 h后播種于蛭石、細沙的培養缽中，每缽10株，每5 d澆灌一次培養液（Hoagland 全營養液），于4 000 lx，25℃光照培養箱中培養至三葉期后，使用雙蒸水對對照組小麥幼苗葉片進行噴施，使用濃度為100 μmol/L的MeJA對實驗組小麥幼苗葉片進行噴施后將幼苗置于4℃低溫條件下處理7 d，第7天后分別取兩組小麥葉片4 g經液氮處理后低溫保存以備用［14］。

1.2.2 生理生化指標測定 小麥幼苗低溫傷害部位主要為葉片，多發萎蔫干枯失綠，隨后發黃變干死亡［15］。7 d低溫處理后，統計成活率；SOD、POD、CAT、MDA、脯氨酸和可溶性蛋白的測定參考高俊鳳、張志良等方法［16-17］，使用Thermo ScientificTMVarioskanTMLUX 多功能微孔板讀數儀測定吸光度。1.2.3 TaCBFs抗寒應答轉錄因子qRT-PCR分析 取兩組小麥幼嫩葉片，TRizol試劑快速提取法提取 RNA［18］，反轉錄體系為 120 μL，20 μL 模板，使用oligo-dT引物法將RNA轉錄為cDNA［19］。根據GenBank數據庫提供的TaCBFⅣd-B4（EF028781）、TaCBF Ⅲ d-B19（EF028767）、TaCBF Ⅲ c-D3（EF028760）和 TaCBFⅢ d-D19（EF028768）基因序列信息［9］，利用Primer Premier 5.0設計引物序列，以GDPDH為參照基因，如表1。使用SYBR Green作為熒光顯示劑進行熒光實時定量PCR，反應總體系為15 μL，正反向引物各0.3 μL，cDNA模板 1 μL，SYBR Green 7.5 μL，雙蒸水 5.9 μL，反應條件：95℃預變性2 min，94℃變5 s，62℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環，65℃15 s生成溶解曲線，40℃冷卻30 s。每個樣品設3次重復。

1.2.4 數據處理分析 使用Excel 2007軟件對實驗數據進行分析作圖，使用IBM SPSS statistics13.0軟件對數據進行單因素方差分析及顯著性檢驗。基因表達量分析使用相對定量分析中的2-△△Ct法分析［20］，計算所得全部數據將處理組矯正為1，以1作為相對表達量，實驗組數據為其相對倍數。

表1 參照基因和TaCBFs抗寒應答因子引物序列

2 結果

2.1 生理生化指標

2.1.1 成活率 低溫處理后對照組3組小麥幼苗成活率平均為84%；而經過外源MeJA噴施的低溫處理的3組小麥幼苗成活率平均數達到91%。除小麥葉片干枯發黃凍死外，冷處理后小麥葉尖有發黃干枯現象，以低溫處理組小麥發生居多。結果（圖1）表明，外源MeJA噴施可以減輕小麥受低溫傷害，從而提高成活率，減少幼苗損失。

圖1 矮抗58小麥幼苗成活率

2.1.2 SOD活性、CAT活性、POD活性以及MDA含量 如圖2所示，經過外源MeJA噴施進行低溫處理后的小麥幼苗中SOD、CAT和POD三種抗氧化酶活性較對照組分別提高了34%、50%和14%，MDA含量降低了5%。結果表明，低溫處理后，外源MeJA的噴施可以有效提高小麥幼苗中SOD、CAT、POD抗氧化酶活性，同時降低MDA含量，通過提高抗氧化酶活性以降低小麥幼苗細胞損傷，提高小麥低溫耐受能力。

2.1.3 可溶性蛋白和游離脯氨酸含量 如圖3所示，外源MeJA噴施低溫冷處理后小麥幼苗中可溶性蛋白和游離脯氨酸含量較對照組分別提高了30%和14%。結果表明，在低溫處理后，外源MeJA的噴施可以有效提高小麥幼苗中的可溶性蛋白含量和游離脯氨酸含量，以此提升小麥抗低溫能力。

2.2 抗寒應答轉錄因子表達分析

如圖4所示，經過外源MeJA噴施低溫處理實驗組小麥幼苗中TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19表達量較對照組有明顯的提高，其中CBFⅣd-B4熒光表達量在4個基因中最高，CBFⅣd-B4基因表達量為對照組34.78倍，TaCBFⅢc-D3基因表達量為對照組的24.2倍，CBFⅢ3d-B19基因表達量為對照組的21倍，CBFⅢd-D19基因表達量為對照組的19.93倍。4個基因表達量結果皆表現為上調表達。結果表明，外源MeJA的噴施可以有效促進TaCBFⅣd-B4、TaCBFⅢd-B19、TaCBFⅢc-D3和TaCBFⅢd-D19的表達以應對冷環境脅迫。

圖2 矮抗58小麥幼苗中SOD（A）、CAT（B）、POD（C）活性及MDA（D）含量

圖3 矮抗58小麥幼苗中可溶性蛋白（A）及游離脯氨酸（B）含量

3 討論

小麥在進入越冬期之前會有較長的低溫期，在經受低溫脅迫時，小麥中抗寒應答轉錄因子CBF基因家族參與低溫脅迫抗逆代謝，CBF轉錄因子在干旱、高鹽及低溫脅迫信號傳遞中能夠起到重要作用［21-22］。近幾年國內外對小麥CBF家族基因的研究主要為轉基因以及抗寒誘導機制方面。CBF轉錄因子可激活具有DRE順式作用原件的多個與干旱、高溫及低溫耐性有關功能基因的表達，從而使得小麥的抗逆性提高［23］。本實驗結果顯示，外源茉莉酸甲酯噴施后，小麥幼苗抗寒應答轉錄因子TaCBFⅣ d-B4、TaCBFⅢ 3d-B19、TaCBFⅢ c-D3和TaCBFⅢd-D19熒光表達量較低溫處理組明顯升高，表明在100 μmol/L濃度下外源MeJA可以誘導以上基因的表達。進一步說明，通過外源茉莉酸甲酯誘導抗寒基因的表達，可以促進小麥細胞內部生理生化機制的抗寒反應，生成小麥抗逆相關酶及抗逆物質，從而提高小麥抗低溫能力。

當小麥受到低溫脅迫時，會產生大量活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS），會對脂膜、蛋白以及遺傳物質造成傷害，MDA是細胞脂膜過氧化后的產物，而SOD、CAT及POD等抗氧化酶可以有效清除ROS，降低MDA含量。可溶性蛋白和游離脯氨酸可以調節胞內滲透壓，降低小麥細胞基質冰點，以此保護細胞免受低溫處理的傷害［24-25］。本實驗結果顯示，外源MeJA噴施的處理組小麥幼苗中SOD、CAT、POD抗氧化酶含量較對照組明顯提高，同時降低了脂膜過氧化產物MDA含量，可溶性蛋白和脯氨酸含量也明顯升高，有效提高了小麥幼苗的抗寒耐受能力，這與齊付國等［14］和劉彧等［26］研究結果相似。已有研究表明，外源MeJA可促進細胞衰老［27］。實驗結果顯示，經過外源MeJA噴施后低溫處理的小麥幼苗存活率顯著升高，降低了小麥死亡率，保證了后期小麥的產量。此外，外源MeJA除提高小麥抗寒能力以及其他環境脅迫抵抗能力之外，還能有效提高小麥抗病性，如白粉病、赤霉病和銹?。?8-29］。

有研究表明，在低溫環境下，外源茉莉酸甲酯的噴施可以有效提高小麥內源茉莉酸的含量［30］，而內源茉莉酸可有效應對小麥受到的傷害以及病原體入侵，當小麥受到低溫馴化后內源茉莉酸含量下降，直至第7天開始回升［31］。生理生化水平及分子水平皆顯示，外源茉莉酸甲酯的噴施可有效提高小麥幼苗的耐寒能力。除此之外，有研究表明，外源水楊酸、赤霉素和脫落酸與茉莉酸甲酯有相似的作用［32-33］。目前，對于外源茉莉酸甲酯在小麥育種生產中的應用還不成熟，原因可能是茉莉酸類物質在植物體中的作用和作用機制還不夠清楚。另外，茉莉酸類物質在市場售價較高，針對大面積作物的使用不夠經濟。因此，外源茉莉酸甲酯對冷處理小麥的作用和作用機制還需進一步地在分子和蛋白水平展開研究。

圖4 矮抗58小麥幼苗中CBF IV d-B4（A）、CBF III 3d-B19（B）、TaCBF III c-D3（C）和CBF III d-D19（D）熒光表達量

4 結論

4℃低溫處理7 d后，外源MeJA的噴施能顯著提高小麥抗氧化酶活性及可溶性蛋白和脯氨酸含量、降低MDA含量，促進抗寒應答轉錄因子TaCBFⅣ d-B4、TaCBFⅢ 3d-B19、TaCBFⅢ c-D3、TaCBFⅢd-D19的表達，提高矮抗58小麥幼苗的低溫耐受性。綜上，通過對小麥幼苗葉片噴施茉莉酸甲酯能夠有效提高小麥幼苗的低溫耐受能力。

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