甜高粱蔗糖積累關(guān)鍵時期葉片轉(zhuǎn)錄組測序分析

陳思孛 趙質(zhì)涵 馬愛軍 張敖 王志和 阮燕曄

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽 110866；2. 遼寧登海種業(yè)有限公司，沈陽 110000）

甜高粱（Sorghum bicolor（L.）Moench）是粒用高粱的一個變種，也稱為蘆粟、甜稈、甜秫秸和糖高粱［1］。甜高粱作為非糧作物的能源植物，由于自身抗逆性比較強(qiáng)，可在干旱半干旱氣候、貧瘠土地等惡劣環(huán)境生長，高度適應(yīng)不同的氣候和土壤，可產(chǎn)生較高的生物產(chǎn)量，是具有巨大潛力的可再生能源作物之一［2］。

甜高粱與普通高粱最大的區(qū)別在于莖稈的糖含量有所不同，因?yàn)樘鸶吡辉诔墒炱跁r通常不產(chǎn)生大的種球，而是將大量的同化物運(yùn)輸分配到莖中。籍貴蘇等［3］利用77個品種的粒用高粱和21個品種的甜高粱作為研究材料，對甜高粱的含糖量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，甜高粱莖稈中糖含量是粒用高粱2-5倍。

葉片作為植物的光合器官，承擔(dān)著將光能轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能的重要作用，是甜高粱蔗糖合成、運(yùn)輸?shù)脑雌鞴?。有研究表明甜高粱在抽穗期與成熟期葉片內(nèi)的蔗糖含量占有很高的比例，在成熟期其占比達(dá)到最大值，最高的相對含量達(dá)到了61.2%，對其蔗糖與總糖的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)蔗糖含量與總糖含量呈顯著正相關(guān)（R=0.914，P＜0.01），所以葉片內(nèi)蔗糖含量的變化是影響甜高粱體內(nèi)總糖含量的根本原因［4］。前人在對甜高粱的不同生長發(fā)育時期葉片中蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）進(jìn)行表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，甜高粱苗期、開花期葉片中SS蛋白質(zhì)表達(dá)量較高，拔節(jié)、抽穗期、臘熟期葉片和莖中SS蛋白質(zhì)表達(dá)量較低。除苗期以外，甜高粱其他時期葉片和莖中SS的表達(dá)與莖中蔗糖含量變化趨勢基本一致，甜高粱莖桿中的蔗糖含量與葉片及莖稈中SS蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)系數(shù)分別為0.777和0.903，這與粒用高粱葉片中SS表達(dá)量變化相比呈現(xiàn)相反的趨勢。說明甜高粱莖中蔗糖富集程度高可能與其葉片中SS蛋白表達(dá)高度相關(guān)［5］。

前人對于甜高粱蔗糖含量的研究多數(shù)集中在甜高粱與粒用高粱糖不同生育時期、不同部位間的含糖量的差異比較，以及在不同生育時期影響蔗糖合成與轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶類活性討論，對于引起甜高粱較粒用高粱在蔗糖合成、轉(zhuǎn)運(yùn)上存在差異的分子機(jī)理鮮有報(bào)道。本研究通過對甜高粱與粒用高粱成熟期葉片轉(zhuǎn)錄組測序分析，尋找其組織間差異表達(dá)的相關(guān)基因，通過GO功能注釋及相關(guān)聯(lián)的Pathway分析，篩選與蔗糖積累與代謝酶類表達(dá)相關(guān)的基因，以利于充分挖掘甜高粱的生物學(xué)潛能，填補(bǔ)甜高粱分子領(lǐng)域研究的空白，以期為甜高粱的定向改良奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試高粱品種為遼甜1號和粒用高粱新蘇2號，2012年5月種植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，于2012年10月選取長勢良好的自旗葉起第四片葉，經(jīng)液氮速凍后-80℃保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測 采用RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒（購于TIANGEN公司）分別提取2個材料總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度及完整性，用Agilent2100進(jìn)一步檢測RNA的濃度和OD260/OD280、OD260/OD230比值。1.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建及Illumina測序 用NEBN Poly（A）mRNA Magnetic Isolation Module富 集mRNA，并以mRNA為模板構(gòu)建cDNA上機(jī)文庫，檢測合格的文庫最后用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行雙末端測序。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估與新基因分析 將各樣品得到的數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對，使用Cufflinks軟件對reads進(jìn)行組裝，并與原有基因組的已知基因模型比較，過濾掉小于200 bp的序列后，發(fā)掘出該物種的新基因。

1.2.4 基因表達(dá)量分析與功能注釋 采用TopHat2將各樣品測序得到的reads與參考基因組進(jìn)行比對，根據(jù)比對信息，利用RPKM值反映對基因的表達(dá)豐度。在差異基因篩選中，選取FDR＜0.01且Flod Change≥2作為標(biāo)準(zhǔn)。將得到的差異表達(dá)基因，利用 BLAST軟件與nr、SwissProt、GO、COG進(jìn)行功能注釋與分類，最后將差異基因與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，分析其相關(guān)的代謝通路。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證 利用QuantScript RT Kit（購于TIANGEN公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的甜高粱與普通高粱成熟期總RNA合成cDNA第一鏈。將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA及所選基因序列委托五福星生物科技有限公司進(jìn)行引物合成與實(shí)時熒光定量檢測。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果與質(zhì)量分析

測序一共獲得71.98 M條reads，總堿基數(shù)為14.54 Gb。在測序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)評估方面，堿基Q30都在81%以上（表1）。使用Tophat軟件將各樣品測序得到的reads與參考基因組進(jìn)行比對，2個樣品的reads與參考基因組比對效率都在82%左右（表2），表明測序及所選參考基因較好，滿足分析需要。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計(jì)表

表2 兩個品種比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.2 基因分析與差異表達(dá)分析

經(jīng)過reads組裝，與原有基因組比較，共發(fā)掘1 562個新基因和3 115個差異基因。在3 115個差異基因中，與對照組相比，試驗(yàn)組有1 499個基因上調(diào)，1 616個基因下調(diào)（圖1）。圖2為RPKM對數(shù)值散點(diǎn)圖，說明樣品間表達(dá)量的相關(guān)性較低，基因間的表達(dá)差異性較大。

2.3 基因功能注釋

2.3.1 新基因功能注釋 使用BLAST軟件對提取的新基因序列與各數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，最終獲得1 562個新基因（表3）。

2.3.2 差異表達(dá)基因注釋 對篩選獲得的3 115個差異基因，提取注釋信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表4）。93.7%（2 918個）的差異基因得到了功能注釋，其中大部分可以通過NR數(shù)據(jù)庫得到其蛋白功能注釋。運(yùn)用不同的蛋白信息庫對蛋白功能進(jìn)行注釋（圖2），通過維恩圖可以清晰地看到，絕大多數(shù)基因可以通過NR數(shù)據(jù)庫得到注釋，只注釋到KEGG、COG數(shù)據(jù)庫的基因相對較少，分別為360和995。多數(shù)基因可以同時至少通過2個庫得到注釋，其中同時注釋到4個數(shù)據(jù)庫的基因有247個。

圖1 樣品成分組間基因表達(dá)量散點(diǎn)圖

表3 新基因功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表4 注釋的差異基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

差異基因的GO分類可分為細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程3大類，57個小類。在細(xì)胞組分功能類型中，一共有2 234個差異基因得到注釋（圖3），其中“細(xì)胞”和“細(xì)胞部分”所占比例最高；在分子功能類型中，一共有2 036個差異基因得到注釋，其中“蛋白結(jié)合”與“催化活性”所占比例最高；生物過程功能類型中，一共有2 151差異基因得到注釋，其中“代謝過程”與“細(xì)胞過程”所占比例最高。

圖2 蛋白功能注釋維恩圖

運(yùn)用COG數(shù)據(jù)庫對基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類（圖4）。在COG功能注釋的25個類別中，“一般功能預(yù)測”為最大組，其次為“復(fù)制、重組及修復(fù)”及“轉(zhuǎn)錄”，最后為“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”，“細(xì)胞運(yùn)動”、“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)”和“核結(jié)構(gòu)”均無差異基因。

運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類和Pathway顯著性富集分析（表5），共264個差異基因富集到94個代謝通路。其中包括光合作用、蔗糖與淀粉代謝、植物病原互作、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、苯丙烷類生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解和糖質(zhì)新生、嘌呤代謝等代謝通路。在這些代謝通路中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)富集的差異基因最多（20，7.58%），其次為蔗糖和淀粉代謝通路（19，7.2%）。在淀粉與蔗糖代謝途徑中，果膠酯酶、尿苷二磷酸葡萄糖6-脫氫酶、海藻糖-6-磷酸合成酶、果糖激酶和α-淀粉酶對應(yīng)的基因都有不同程度的上調(diào)。α-1、4半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、海藻糖-6-磷酸合酶、磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶和淀粉合酶對應(yīng)的基因有不同程度的下調(diào)。尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構(gòu)酶、β-呋喃果糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和蔗糖合酶對應(yīng)的基因部分上調(diào)部分下調(diào)。其中尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸酯-4-表異構(gòu)酶對應(yīng)的Sb02g029130基因下調(diào)最大，log2（FC）為-5.943 37。β-葡萄糖苷酶對應(yīng)的Sb06g022450基因上調(diào)幅度最大log2（FC）為6.518 021。

圖3 差異基因GO注釋聚類圖

圖4 差異基因COG注釋分類圖

表5 KEGG pathway注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證

從RNA-Seq測序結(jié)果中挑取在遼甜1號與普通高粱成熟期不同程度差異表達(dá)的8個基因（表6），以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析，并根據(jù)其在甜高粱與普通高粱成熟期葉片中表達(dá)情況是否與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相吻合，判斷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

通過實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證（圖5）。對樣品中隨機(jī)選取的8個基因在遼甜1號與普通高粱的相對表達(dá)量分析，其結(jié)果基本與轉(zhuǎn)錄組測序趨勢相同，證明轉(zhuǎn)錄組測序獲得的結(jié)果信息準(zhǔn)確度較高，可靠性較強(qiáng)。

表6 實(shí)時定量PCR驗(yàn)證基因

2.5 實(shí)時熒光定量PCR分析

從淀粉與蔗糖代謝通路（Pathway ID：Ko00500）中取幾個關(guān)鍵酶的差異基因，分別為Sb06g031910、Sb06g023760、Sb01g035890、Sb01g033060 和Sb10g008280。進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表7），以β-actin為內(nèi)參基因，以遼甜1號為試驗(yàn)組，普通高粱為對照組，分別在苗期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期4個生長發(fā)育時期隨機(jī)取樣，取材部位為自旗葉起第四片葉子，每個樣品3個重復(fù)，進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析（表8）。與對照相比，β-呋喃果糖苷酶調(diào)控基因Sb06g031910在遼甜1號苗期、拔節(jié)期的表達(dá)量下調(diào)，抽穗期與成熟期表達(dá)量上調(diào)。在拔節(jié)期下調(diào)程度最大，在成熟期上調(diào)程度最大。β-呋喃果糖苷酶調(diào)控基因Sb06g023760在遼甜1號4個生長時期均呈現(xiàn)下調(diào)，拔節(jié)期與抽穗期下調(diào)幅度最小。蔗糖合成酶調(diào)控基因Sb01g035890在遼甜1號苗期、抽穗期表達(dá)下調(diào)，拔節(jié)期成熟期上調(diào)。在苗期表達(dá)量差異最大，下調(diào)程度最明顯。成熟期上調(diào)差異最大。蔗糖合成酶調(diào)控基因Sb01g033060在遼甜1號苗期、拔節(jié)期、抽穗期表達(dá)量上調(diào)，成熟期下調(diào)。并且在成熟期的相對表達(dá)差異最大。果糖激酶Sb10g008280基因在遼甜1號中下調(diào)，拔節(jié)期和成熟期上調(diào)。在苗期和成熟期表達(dá)差異不顯著，在拔節(jié)期上調(diào)程度最大。

圖5 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)量差異的比較

3 討論

甜高粱是重要的能源作物，已為世界各國所認(rèn)同，了解其糖分組成及決定因素對提高糖分含量具有重要意義。甜高粱中參與蔗糖代謝相關(guān)的酶主要是蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶和轉(zhuǎn)化酶［6］。

表7 實(shí)時熒光定量PCR引物

表8 五個基因各時期表達(dá)量

β-呋喃果糖苷酶為蔗糖轉(zhuǎn)化酶中的酸性轉(zhuǎn)化酶，可以分解β-果糖類寡糖，催化蔗糖不可逆水解成葡萄糖。主要為可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞壁結(jié)合酸性轉(zhuǎn)化酶，這兩類形態(tài)的轉(zhuǎn)化酶分別是由兩類完全不同的基因家族編碼［7］。聶元冬等［8］利用電子克隆與RT-PCR技術(shù)克隆得到甜高粱SAI-1基因全長序列，發(fā)現(xiàn)高、中糖品種甜高粱葉片中SAI-1表達(dá)的總和均明顯的高于低糖品種，在甜高粱成熟期總糖和蔗糖含量均與葉片中SAI-1的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。本研究β-呋喃果糖苷酶的Sb06g031910基因和Sb06g023760基因在甜高粱4個生長發(fā)育時期的表達(dá)模式不盡相同，b06g031910在苗期與拔節(jié)期處于下調(diào)趨勢，在抽穗期與成熟期處于上調(diào)，在成熟期上調(diào)程度最為明顯，這與前人的研究是相一致的。Sb06g023760在4個時期基本都處于下調(diào)趨勢，成熟期的相對表達(dá)量都處于最大值，而此時葉片的酸性轉(zhuǎn)化酶活性最低，蔗糖含量達(dá)到最大值。推測Sb06g023760可能在調(diào)控β-呋喃果糖苷酶的活性中發(fā)揮不同的功能，在成熟期發(fā)揮作用最大。

蔗糖合成酶在蔗糖代謝過程中既可以催化蔗糖合成又可催化其分解，是一種可逆酶，其作用取決于反應(yīng)的底物濃度以及pH值（蔗糖合成最適pH8.0-9.5，蔗糖裂解最適pH5.5-6.5），但通常認(rèn)為蔗糖合成酶主要起分解蔗糖的作用，即蔗糖合成酶催化蔗糖和UDP的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生UDP-葡萄糖和果糖［9］。安云蓉［10］指出蔗糖合成酶基因的表達(dá)差異很有可能是造成甜高粱與普通粒用高粱莖桿糖分含量存在差異的原因。Zhang等［11］根據(jù)在擬南芥中存在的六個蔗糖合成酶基因，在高粱中找到相應(yīng)的同源蔗糖合成酶基因家族成員SbSusy1（Sb01g033060）和SbSusy4（Sb01g035890）。在本研究中蔗糖合成酶家族中的這兩個基因的表達(dá)模式不盡相同，推測這兩個基因可能控制蔗糖合成酶在甜高粱的生長發(fā)育不同階段發(fā)揮不同功能。并且其在成熟期的表達(dá)差異也與RNA-Seq一致，SbSusy1下調(diào)，SbSusy4下調(diào)。SbSusy1在成熟期下調(diào)程度相對較大，推測其可能在此時期對蔗糖合成酶的功能影響較大；SbSusy4在苗期下調(diào)程度相對較大，成熟期上調(diào)較大，證明其分別在這兩個時期發(fā)揮作用較大。

果糖激酶作為己糖激酶的一種，催化果糖的磷酸化，在植物庫組織的代謝和分配中起主要作用［12］。Sb10g008280為高粱果糖激酶基因家族的SbFRK2。在本研究中其在遼甜1號和粒用高粱的拔節(jié)期表達(dá)量差異最大，而此時葉片中果糖含量也相對較高，因此推測其在此時期對果糖激酶發(fā)揮較大作用。

4 結(jié)論

本研究采用RNA-Seq技術(shù)比較了遼甜1號與粒用高粱成熟期葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過差異表達(dá)篩選出3 115個差異基因，其中1 499個基因上調(diào)，1 616個基因下調(diào)。將差異表達(dá)的基因進(jìn)行了GO、COG等功能注釋和代謝途徑分類，初步明確了各個基因編碼蛋白的功能。共計(jì)93.7%（2 918個）差異基因得到了功能注釋。在富集的94個代謝通路中，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和淀粉與蔗糖代謝通路富集差異基因最多，分別為20和19個。植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中上調(diào)基因6個，下調(diào)基因14個；淀粉與蔗糖代謝通路中上調(diào)基因10個下調(diào)基因9個。從淀粉與蔗糖代謝通路（Pathway ID：Ko00500）中選取5個差異基因（Sb06g031910、Sb06g023760、Sb01g035890、Sb01g033060和 Sb10g0082805）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在不同生育時期的表達(dá)與其對應(yīng)酶類的活性有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，推測其在甜高粱葉片積累蔗糖的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

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