P5CR基因的進化及其在木薯中的表達分析

丁澤紅 付莉莉 顏彥 鐵韋韋 胡偉

（中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海口 571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科熱帶和亞熱帶地區重要的薯類作物，具有高產、高淀粉和耐貧瘠等特點，在現代工業和農業中起著非常重要的作用。木薯具有發達的根系，可以忍受長達4-6個月的干旱脅迫［1］。然而，在這種長時間（或較為嚴重）的干旱脅迫條件下，木薯的生長和發育受到顯著了的影響，最終導致其塊根產量減少［2］。作為典型的熱帶塊根作物，木薯主要種植在南北緯30°之間的熱帶和亞熱帶地區。木薯對溫度非常敏感，低于14℃時木薯生長會明顯變緩，低于10℃時木薯將停止生長。更為嚴重的是，在極端的低溫天氣下木薯塊根產量會急劇下降甚至絕收［3］。因此，提高木薯抵御干旱和低溫等脅迫的抗性，對減少木薯在不良生長環境下的產量損失具有重要指導意義。

脯氨酸是重要的滲透調節物質，在植物體內起著調節細胞滲透平衡、維持細胞結構穩定和清除活性氧等作用［4］。在干旱、低溫、高鹽等脅迫條件下，植物體內脯氨酸含量會顯著增加［5-6］，其含量和植物的抗逆性呈正相關［7］。植物脯氨酸合成途徑可以分為兩種：鳥氨酸途徑和谷氨酸途徑。有趣地是，這兩種途徑的最后一步反應相同，均由吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）催化完成，可見P5CR是脯氨酸生物合成途徑的關鍵酶，由其催化的反應對植物生長可能至關重要，例如在擬南芥中敲除P5CR后可引起植株胚胎致死［8］。此外，在植物中超表達P5CR后，轉基因植株在脅迫條件下脯氨酸含量顯著增加，其抗逆性顯著增強［9］。

大多數植物中P5CR僅由1個基因編碼，它們在進化過程中比較保守，屬于看家基因（Housekeeping genes）［10］。P5CR的表達在不同組織中存在顯著差異。例如，擬南芥中AtP5CR在根中表達量最高，其次是果莢、花和葉，而莖中的表達量最低［11］。P5CR的表達還受到干旱、低溫、鹽和ABA等的誘導。例如，擬南芥AtP5CR的表達量受到低溫、高溫和鹽脅迫的誘導［12-13］；黑麥草LpP5CR的表達受到鹽、PEG（Polyethylene glycol）、低溫和ABA（Abscisic acid）處理的誘導［14］；而小麥TaP5CR的表達則受到鹽、PEG和ABA處理的誘導［9］。這些研究成果為在其他植物中挖掘和鑒定P5CR的功能奠定了重要基礎。

迄今為止，在木薯中已經克隆了一個P5CR，其表達在轉錄水平受到滲透脅迫的調控［6］。然而，在木薯中是否還存在其他的P5CR，它們和其他植物中P5CR的進化關系如何以及它們是否參與了木薯干旱、低溫等脅迫響應，仍不清楚。本研究擬采用生物信息學的方法從已完成基因組測序的植物中鑒定P5CR，并對其序列特征和進化模式進行分析；之后主要針對木薯MeP5CR，分析其在不同組織以及干旱、低溫等脅迫條件下的表達模式，旨在為進一步研究MeP5CR在木薯非生物脅迫中的功能奠定基礎，同時也為其他植物中P5CR的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用木薯材料為主推廣品種Ku50，由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與處理 參照丁澤紅等［15］方法進行木薯種植：將具有3-4個芽眼且粗細勻稱的木薯莖段（長度約15 cm）扦插于塑料盆（高×上直徑×下直徑 = 18.8 cm×18.5 cm×14.8 cm）中，每盆1個莖段。基質采用蛭石與營養土按照1:1的體積比進行混合。木薯種植約10 d后進行間苗，每盆保留1棵苗。

木薯種植60 d后，選取長勢一致植株分別進行（1）干旱處理：采用20%的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，在處理0、3和24 h后，分別收集老葉、第一片完全展開葉、未展開葉和根的樣品，-80℃保存待用；（2）低溫處理：采用4℃進行低溫脅迫處理，在0、6和24 h后分別收集第一片完全展開葉、未展開葉和根的樣品，-80℃保存待用。

為考察MeP5CR在不同組織中的表達變化，收集正常種植條件下木薯Ku50的葉片、葉柄、莖、須根和儲藏根的樣本，進行qRT-PCR分析。

1.2.2 RNA提取與qRT-PCR 用天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒提取木薯總RNA。用Fermentas公司反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，-20℃保存待用。用Primer 6.0設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。qRTPCR在Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國）上進行，每個樣品3次生物學重復，按照2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量［6］。

1.2.3 生物信息學分析 以擬南芥［16］、水稻［17］中P5CR的蛋白質序列為參考，用BLASTP搜索Phytozome數據庫獲取其他物種的P5CR同源序列。在去除冗余序列之后，用NCBI-CDD數據庫進行保守結構域分析，確保每條序列都含有P5CR保守結構域。之后，用ClustalX進行序列比對；用MEGA5.2構建Neighbor-Joining系統進化樹；用ExPASy ProtParam分析蛋白質的分子量和等電點。

表1 qRT-PCR引物

2 結果

2.1 P5CR在不同物種中的分布

以擬南芥和水稻中P5CR為查詢序列，搜索Phytozome數據庫，在45個物種中共找到54條P5CR序列，其中蘋果P5CR數目最多，為3個，其次是柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亞麻、大豆，為2個，在主要單子葉植物（如水稻、玉米、小米、高粱等）和雙子葉植物（如擬南芥及其近緣種鼠耳芥等）中有且僅有1個P5CR（圖1和表2）。木薯與杞柳、毛果楊親緣關系較近，它們僅有1個P5CR。除此之外，在許多低等生物如團藻、萊菌衣藻、鹽生杜氏藻、小立碗蘚和泥炭蘚中也只有1個P5CR（圖1）。

序列特征分析表明，P5CR平均氨基酸長度為282.6，最大值為347，最小值為208；平均外顯子數目為7.2，最大值為9，最小值為6（表2）。P5CR的分子量和等電點在不同物種之間的差別不大。相比之下，P5CR長度的最大值為9 797 bp，最小值為1 174 bp，兩者相差9倍之多（表2）。可見，P5CR在基因長度上差別較大，且這種差異主要是由內含子長度上的差異造成的。

圖1 P5CR基因在不同物種中的分布

2.2 P5CR進化分析

將54條P5CR氨基酸序列進行比對、聚類后發現，它們可以分成12個主要組群（圖2）。其中，木薯與巨桉中P5CR的親緣關系較近，聚類在一起（圖2-K）。可以清楚的看到，各物種中P5CR的親緣關系與物種之間的進化關系呈現很好的一致性：低

等藻類和蘚類植物（如團藻、萊菌衣藻、泥炭蘚和小立碗蘚等）都聚類在A組，單子葉植物（如水稻、高粱、玉米和二穗短柄草等）都聚類在B組，雙子葉植物（如擬南芥、琴葉擬南芥和鼠耳芥等）都聚類在D組，豆科植物（如大豆、菜豆和蒺藜苜蓿等）都聚類在L組，且大多數植物中都只有1個P5CR（圖2）。不同組群之間P5CR長度的統計結果顯示，除了個別組群中P5CR的長度要顯著的低于或高于其他組群，如D組（雙子葉植物）中P5CR長度最小（～1 600 bp）、F組（茄科植物）和J組（可可和雷蒙德氏棉）中P5CR長度最大（＞6 000 bp），大多數組群中P5CR的長度都保持在4 000 bp左右，差異不顯著（圖3）。結果表明，P5CR在各物種之間非常保守，且是單基因起源的。

表2 本研究中鑒定到的P5CR

續表

在少數物種中P5CR仍發生了2-3次重復，并可以將它們歸納成3種進化模式。模式I：種內進化模式，即只在兩近緣物種中的某一物種發生重復。例如，大豆和菜豆都屬于豆科植物，親緣關系較近，大豆中有2個P5CR（GmP5CR1和GmP5CR2），而菜豆中只有1個P5CR（PvP5CR），且它們聚類在一起（圖2-L）；模式Ⅱ：種間進化模式，即在兩近緣物種中均發生重復。例如，卷心菜和白菜型油菜都屬于蕓苔屬植物，親緣關系較近，卷心菜和白菜型油菜中均有2個P5CR，且卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2分別和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2聚類在一起（圖2-D）；模式Ⅲ：種間與種內進化模式共存。巴旦木和蘋果親緣關系較近，本研究發現巴旦木PpeP5CR1和蘋果MdP5CR1、MdP5CR3聚類在一起（圖2-C），而巴旦木PpeP5CR2和蘋果MdP5CR2聚類在一起（圖2-H）。以上結果表明，P5CR呈現多樣性的進化模式。

2.3 MeP5CR在不同組織中的表達情況

采用qRT-PCR方法檢測MeP5CR在木薯不同組織中的表達情況。結果（圖4）表明，MeP5CR在葉片、須根和儲藏根中表達量最高，且三者之間的表達量無顯著差異；MeP5CR在葉柄和莖中的表達量最低，僅是葉片中表達量的48%和51%。說明MeP5CR主要是在木薯葉片、須根和儲藏根中起作用。

2.4 MeP5CR對干旱和低溫脅迫的響應

采用qRT-PCR方法在木薯不同葉片（如第一片完全展開葉、未展開葉及老葉）和根中，分別檢測MeP5CR對干旱（PEG模擬）和低溫脅迫的響應情況。在PEG脅迫條件下，在老葉中MeP5CR呈現先不變后下降的變化趨勢，在24 h其表達量顯著下降約36%；在第一片完全展開葉MeP5CR呈現先下降后上升的變化趨勢，在3 h和24 h其表達量分別下降20%和提高1.3倍；在未展開葉和根中，MeP5CR呈現持續下降的變化趨勢，在24 h其表達量分別下降23%和9%（圖5-A）。

在低溫脅迫條件下，在未展開葉中MeP5CR的表達量呈現先上升后下降的變化趨勢，在6 h其表達量提高3.7倍，在24 h其表達量又回復到初始水平；在根中MeP5CR的表達量也呈現先上升后下降的變化趨勢，在6 h和24 h其表達量分別提高1.9倍和下降59%；在第一片完全展開葉中，MeP5CR的表達量呈現持續上升的變化趨勢，在6和24 h其表達量分別提高3.4倍和5.9倍（圖5-B）。

綜上所述，MeP5CR在轉錄水平參與木薯干旱和低溫脅迫響應。

圖2 植物中P5CR的進化樹分析

圖3 不同組群中P5CR長度的變化

圖4 MeP5CR在不同組織中的表達

3 討論

P5CR屬于看家基因，在大多數植物中有且僅有1個拷貝［10］。盡管目前已陸續從擬南芥、水稻、黑麥草、木薯等植物中克隆了P5CR［6，14，17］，但這些研究僅關注于少數幾個物種的P5CR親緣關系，無法全面系統地了解P5CR的進化歷史。本研究采用生物信息學方法，從已經完成基因組測序的45個植物中共鑒定出54條P5CR序列，并考察了它們在不同植物中的分布情況（圖1）。結果表明，在主要農作物（水稻、玉米、小米、高粱）和模式植物擬南芥中都僅有1個P5CR，與前人研究結果一致［10］。在木薯中也只有1個P5CR成員。與前人報道不同的是，本研究發現至少在8種植物（包括蘋果、柳枝稷、卷心菜、白菜型油菜、落地生根、巴旦木、亞麻、大豆）中存在2-3個P5CR（圖1），暗示P5CR在這些植物中存在不一樣的進化過程。序列特征分析表明，各植物中P5CR的氨基酸長度、分子量大小、和外顯子數目相差不大，但基因長度的變化幅度非常大。進一步分析表明，基因長度的變化主要是由內含子長度的變化引起的，且這種變化與物種進化的關系非常密切（圖3）。

圖5 MeP5CR對干旱和低溫脅迫的響應

聚類分析表明，各物種中P5CR的親緣關系與物種之間的進化關系呈現很好的一致性。而且，無論是在低等藻類蘚類植物中，還是在高等單子葉和雙子葉植物中，大多數物種有且僅有1個P5CR，與前人研究結果一致［10］。說明P5CR是單基因起源的，且在各物種之間非常保守。盡管如此，仍有少數物種中的P5CR發生了2-3次重復：這些重復或只發生在某一物種內部，如P5CR基因在大豆（GmP5CR1和GmP5CR2）中發生了一次重復，但在菜豆中沒有發生重復；或發生在某兩近緣物種分化之前，并在分化之后繼續保留在兩近緣物種中，如卷心菜BoP5CR1和BoP5CR2和白菜型油菜BrP5CR1和BrP5CR2；或以上2種情況同時發生，如巴旦木和蘋果中的P5CR基因（圖2）：產生這種結果的最大可能性是，在巴旦木和蘋果分化之前，P5CR基因發生一次重復，使得巴旦木和蘋果中分別保留有2個P5CR基因（PpeP5CR1和PpeP5CR2，和MdP5CR1和MdP5CR2）；在巴旦木和蘋果分化之后，巴旦木中的P5CR基因維持不變，而蘋果中的P5CR基因再次發生一次重復（如MdP5CR1發生重復獲得MdP5CR3）。這一推測從基因組結構分析上也得到了驗證：PpeP5CR1和PpeP5CR2、MdP5CR1和MdP5CR2在染色體上分別成串聯重復排列，且相互之間具有共線性。值得強調的是，本研究并沒有發現在某一植物不存在P5CR，這可能是因為P5CR丟失后會引起植株致死［8］。以上結果比較系統地闡述了P5CR在植物中的進化方式，為進一步研究其在不同物種中的功能奠定基礎。

P5CR在不同植物中非常保守，暗示它們可能具有相同的功能，在基因表達水平上通常表現為相同的表達模式。擬南芥中AtP5CR在莖中的表達量最低，而在根中表達量最高［11］；木薯中MeP5CR也表現出相同的表達模式，支持“根是脯氨酸生物合成的主要場所，而莖則主要是負責脯氨酸的運輸”的結論［11］。研究表明，P5CR的表達還受到干旱、低溫、鹽和ABA等處理的誘導。例如，在低溫脅迫條件下，AtP5CR的表達量上升了約3倍［12］；在鹽、PEG、低溫和ABA處理條件下，LpP5CR的表達量被誘導了約2-4倍［14］。本研究發現，在低溫脅迫條件下，MeP5CR的表達量在未展開葉、第一片完全展開葉、和根中分別上升了3.7倍、5.9倍和1.9倍；然而，在干旱條件下，MeP5CR的表達量卻被顯著的抑制了，暗示不同植物中P5CR對同一脅迫的響應可能是不一樣的。本研究結果將有助于深入了解P5CR在不同植物中的進化模式，同時也為進一步研究MeP5CR在木薯干旱和低溫等逆境脅迫中的功能奠定基礎。

4 結論

在不同植物中，P5CR內含子長度差別較大，而在氨基酸長度、外顯子數目、等電點和分子量方面差別不大。在大多數植物（如木薯）中，P5CR有且僅有1個拷貝，在進化上比較保守；而在某些植物（如大豆、蘋果等）中有2-3個拷貝，并將其進化方式歸納為3種模式。木薯MeP5CR在葉片、須根和儲藏根中表達量最高，而在葉柄和莖中的表達量最低。此外，MeP5CR表達量受到低溫脅迫誘導、但被干旱脅迫抑制。

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