牦牛KISS-1基因的克隆及其在生殖軸的表達

楊遠瀟 字向東

（1. 西南民族大學青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041）

牦牛主要分布于青藏高原及其毗鄰地區，因其對高寒、低氧條件的獨特適應性而聞名于世。由于其他畜種不能適應這樣極端的氣候條件，牦牛成為青藏高原不可替代的主導畜種，提供的乳、肉、毛和皮等畜產品，是青藏高原人民賴以生存的生活資料和生產資料。牦牛為季節性繁殖的動物，發情季節主要集中在6-10月，繁育性能低下，多介于兩年一胎和五年兩胎之間，年均0.45胎［1］，而黃牛是全年發情的家畜，其發情配種繁殖基本不受季節影響［2］。目前，對牦牛季節性繁殖的分子調控機制知之甚少。

轉移抑制素（Kisspeptin）是腫瘤轉移抑制基因（KISS-1）編碼的多肽，是Lee等［3］在1996年應用消減雜交和差異顯示技術對人黑色素瘤細胞株不同轉移能力進行研究時發現的，具有抑制腫瘤轉移的作用。KISS-1與其同源受體KISS-1R組成的KISS-1/KISS-1R系統在人、羊及鼠等在下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA）繁殖機制中調節下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放［4］，從而影響促性腺激素促性腺激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）與促黃體素（Luteinizing hormone，LH）的分泌和釋放，對哺乳動物生殖內分泌起到樞紐作用［5］。卵巢作為促性腺激素的靶器官，其影響雌激素的合成及卵子的發生，從而調控動物的繁殖行為［6］。對季節性休情期的母綿羊用Kisspeptins處理，可以引發LH峰，促進其排卵［7-8］，證明Kisspeptins是母綿羊季節性繁殖的關鍵性因子。在倉鼠［9-10］、歐洲黑鱸［11］等季節性繁殖的生物上的研究也證明Kisspeptins參與其季節性繁殖活動的調節。大腦腹內側視周核（Anteroventral periventricular nucleus，AVPV）和弓狀核（Arcuate nucleus，ARC）是Kisspeptins調節動物繁殖活動的主要作用位點，但目前的研究證明Kisspeptins也能作用于腦垂體、卵巢、輸卵管、子宮及胎盤等其他組織器官發揮調控作用［12-13］。因此，本研究以季節性發情的牦牛和常年發情的黃牛為實驗對象，通過對KISS-1基因的cDNA克隆、序列分析、組織表達比較分析，旨為探索牦牛KISS-1在其季節性繁殖中的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 從四川省德陽市向陽屠宰場購得健康成年母牦牛與黃牛各5頭，取其下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮組織，迅速放入液氮中保存。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL2000、2×Taq PCR Master Mix、DNA 凝膠回收試劑盒為上海天根生物科技有限公司產品；Trizol Reagent為Invitrogen產品；大腸桿菌DH5α感受態細胞為康迪生物技術有限公司產品；反轉錄試劑盒、克隆載體pMD-19 Vector、IPTG、X-Gal、氨芐青霉素（Amp）均為大連寶TaKaRa生物工程有限公司產品；SsoAdvancedTMSYB R Green Supermix為DBI Bioscience公司產品。

1.1.3 引物設計和合成 根據NCBI上已發表的普通牛KISS-1基因序列（XM_867473.4），利用Primer Premier 5設計牦牛KISS-1基因的克隆引物，引物序列見表1。引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 取牦牛和黃牛的下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮組織各0.6 g放入預先用液氮冷卻的研缽內，研磨成粉，然后加入Trizol Reagent分別提取總RNA。采用 TaKaRa 的 PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser（DRR047A）試劑盒進行反轉錄反應，以Oligo dT為引物，合成第一鏈cDNA，反轉錄反應程序為37℃ 15 min；85℃ 5 s，然后4℃保存。反轉錄后，得到的cDNA作為qPCR實驗的模板，置于-80℃冰箱備用。

1.2.2 牦牛KISS-1基因的克隆和測序 用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測并用DNA膠回收試劑盒進行回收。將4.5 μL純化回收產物、0.5 μL pMD-19Vector和 5 μL Solution 在16℃的條件下連接2 h。連接后的產物再轉化100 μL宿主菌E. coli DH5α感受態細胞過夜，再涂布于含有0.1%的氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養基上，涂布至干后于37℃恒溫培養12-16 h。最后，用滅菌槍頭挑取白色單克隆菌落于含有Amp（濃度為0.1%）的LB液體培養基中震蕩培養6-8 h，挑選含目的基因片段的陽性單克隆菌液送至公司進行測序。

1.2.3 實時熒光定量PCR 根據已測序得到的牦牛KISS-1的基因序列設計定量引物，引物序列見表1。對牦牛及黃牛的下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮中的KISS-1基因的mRNA表達量進行RT-PCR檢測，以GAPDH作為內參基因。反應條件為：95℃預變性2 min；95℃變性10 s，68.5℃退火 30 s，65℃延伸5 s；95℃ 5 s；共40個循環。每個樣品設置3個重復，并設置陰性對照，取平均值，用2-△△Ct法計算各基因表達量。定量結果用SPSS16.0軟件t檢驗進行物種間差異顯著性檢驗，用方差分析進行組織間差異顯著性檢驗。

1.2.4KISS-1基因的生物信息學分析 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST在線工具進行同源性比對分析；利用ORF finder在線軟件對牦牛KISS-1基因進行開放閱讀框分析并翻譯；利用DNAstar、DNAMAN軟件對相應物種的KISS-1基因序列進行序列對比和同源性比對；利用MEGA6.0采用鄰接（Neighbor joining，NJ）法構建基于KISS-1氨基酸序列的分子系統發育樹；利用在線軟件ExPASyProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析推導蛋白質的基本理化性質；利用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構域；利用SignalP 4.0（http://www.cbs.dtu.dk/service s/Signal P/）預測信號肽序列。

2 結果

2.1 RT-PCR

利用RT-PCR方法對KISS-1基因進行擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示得到的克隆產物條帶（583 bp）與預期目的片段大小相符。

2.2 牦牛KISS-1基因cDNA序列分析

利用DNAman對測序結果進行拼接得到與預期相符的片段。序列分析結果顯示，KISS-1序列大小為583 bp，其中ORF為408 bp，編碼135個氨基酸，5'非翻譯區（UTR）為59 bp，3'非編碼區UTR為116 bp。推測氨基酸序列（圖2）。并用DNAMAN對其堿基組成進行分析，堿基分析結果顯示 A=20.00%，C=30.00%，G=32.2%，T=17.80%，X=0.0%，（C+G）＞（A+T）。并與NCBI所提供的黃牛KISS-1基因（登錄號為xm_867473.4）用DNAMAN進行比較，發現有7個突變位點（表2）。經分析發現，牦牛的KISS-1與黃?；蛐蛄械耐葱詾?8.28%，氨基酸的同源性為97.04%。

圖1 KISS-1基因PCR產物電泳檢測

2.3 物種間KISS-1基因同源性比較

Blast發現，牦牛KISS-1基因核苷酸序列與其他物種的同源性較高，其中，與黃牛（XM_867473）KISS-1基因的核苷酸序列同源性最高，為98.3%，但仍有7處堿基差異；其次是與藏山羊（NM_001285710）、綿羊（NM_001306104）的同源性為94.6%、93.1%，有28處堿基差異；再次是與野豬（NM_001134964）的同源性為80.9%；而與褐家鼠（NM_181692）、人（NM_002256）的同源性相對較小，分別為77.5%和70.8%（圖3）。由核苷酸序列推導的氨基酸序列比較可知（圖4），牦牛KISS-1編碼的氨基酸序列與黃牛、藏山羊、綿羊、野豬、人、褐家鼠的同源性分別為97.0%、89.6%、85.0%、65.0%、55.0%和51.5%。

2.4 牦牛及其他6種哺乳動物KISS-1氨基酸序列的遺傳進化關系分析

利用Mega6.0對相應物種的KISS-1氨基酸序列進行多序列一致性對比，計算出遺傳距離，并構建基因Neighbor-joining（NJ）系統發生樹（圖5）。結果表明，在氨基酸進化樹中，牦牛與黃牛先聚為一類，再依次與綿羊、藏山羊、褐家鼠聚為一類，最后與野豬、人聚為一類。系統發生樹的構建結果與核苷酸、氨基酸同源性比對結果一致，表明牦牛的KISS-1基因與黃牛最為接近。

圖2 牦牛KISS-1克隆序列及推測氨基酸序列

表2 牦牛和黃牛KISS-1基因序列差異

2.5 牦牛KISS-1蛋白性質分析

利用軟件ExPASyProtParam分析推導牦牛KISS-1蛋白質的結果顯示，其分子質量為 47 365.40；理論等電點PI=5.09，說明為酸性蛋白；分子式為C1623H2665N583O667S198，原子總數為573 6；不穩定指數為50.39，屬不穩定蛋白；在哺乳動物紅細胞中的半衰期為 30 h；脂肪系數為15.95，平均親水系數均為0.893；該蛋白由丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）和蘇氨酸（Thr）構成，因此推測為親水蛋白，且整體不帶電。TMHMM2.0 Server程序進行跨膜區預測，結果表明不存在跨膜區域；SignalP 4.0 Server程序預測信號肽，KISS-1含有17個氨基酸的信號肽，位于序列的上游。

2.6 目的基因組織表達量分析

本實驗通過實時熒光定量PCR技術，以GAPDH基因為參照（引物序列見表1），檢測KISS-1基因在牦牛和黃牛不同組織間的mRNA表達量，結果（圖6）發現KISS-1基因在兩物種的下丘腦、腦垂體、卵巢、輸卵管、子宮中均有表達，且在下丘腦中和腦垂體中的表達豐度高。KISS-1基因在下丘腦中和腦垂體中的表達量在兩個物種間無顯著差異（P＞0.05），但在輸卵管、卵巢、子宮中的表達量在兩物種間存在極顯著差異（P＜0.01）。

3 討論

本實驗選取處于發情期的牦牛和黃牛為研究對象，克隆得到了包含完整編碼區KISS-1基因cDNA序列。KISS-1基因編碼區長度為408 bp，編碼135個氨基酸。與普通牛相比，牦牛存在7處突變位點，其中5個位點的氨基酸發生改變。分子質量為47 365.40，平均親水系數均為0.893，推測該蛋白具有親水性，不穩定指數為47.81，屬于不穩定蛋白，SignalP 4.0 Server程序預測信號肽，KISS-1含有17個氨基酸的信號肽，位于序列的上游。這些特性與在其它物種的研究結果基本一致［14-16］。本研究中，牦牛的KISS-1基因編碼區在核苷酸序列上同源性都在70%以上，而在氨基酸序列上牦牛與黃牛的親緣關系最近，達97%；其次是藏山羊、野豬等，與褐家鼠的親緣關系最遠。同時通過對KISS-1氨基酸序列構建系統發生樹聚類分析也發現，牦牛和黃牛先聚為一支；其次是與綿羊、藏山羊和褐家鼠聚為一支；最后與野豬、人聚為一支。

圖3 牦牛及其他6 個物種KISS-1基因編碼區核苷酸序列比較分析

圖4 牦牛及其他6 個物種KISS-1基因氨基酸序列比較分析

圖5 不同物種間基于KISS-1氨基酸序列構建的進化樹

本研究通過RT-PCR檢測KISS-1基因在牦牛和黃牛不同組織的表達水平，結果顯示其在下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管及子宮均有表達，在下丘腦和腦垂體中的表達量最高，而在子宮中表達量最低。KISS-1基因的組織表達特性與KISS-1主要調節下丘腦GnRH［4］及腦垂體FSH和LH的分泌與釋放的生理功能相吻合［5］。在綿羊、倉鼠、歐洲黑鱸等物種都已證明，KISS-1基因的表達對季節性繁殖活動具有重要調控作用［7-11］。雖然本研究發現季節性發情的母牦牛與全年發情的黃牛在下丘腦、腦垂體中KISS-1基因表達量無顯著差異，但是牦牛樣品均采自發情季節，因此，牦牛KISS-1基因表達量在季節性乏情期與發情季節的差異值得進一步研究。目前，已有足夠的證據認為kisspeptins作為GnRH脈沖分泌中央調制器，在青春期啟動和在人類兩性生殖中起著重要的調控作用。研究發現，Kisspeptin與臨床上引起不孕的疾病密切相關，如多囊卵巢綜合癥（PCOS），這是一種代謝異常及內分泌異常的疾病，Jeon等［17］研究發現PCOS患者血清中Kisspeptin水平明顯升高；再比如高泌乳素血癥，其影響了排卵，導致月經失調和不孕，Charlotte等［18］發現在小鼠中，高泌乳素血癥不僅直接抑制Kisspeptin分泌，同時通過阻止GnRH的分泌而有效地阻斷卵巢周期性。此外Kisspeptin與其他生殖內分泌疾病也存在相關聯系，如KISS-1r基因敲除的小鼠表現出特發性低促性腺激素性腺功能減退癥［19］，推測Kisspeptin與卵巢功能存在潛在聯系。同時，An等［20］在2013年研究發現，KISS-1基因的多態性與山羊的多胎性相關；El-Tarabany等［21］的研究進一步證明，KISS-1基因的多態性通過影響山羊的雌二醇、孕酮等激素的分泌水平而影響山羊的產羔率。但牦牛屬于季節性繁殖，而黃牛繁殖則沒有明顯的季節限制，所以KISS-1基因是否引起牦牛季節性繁育的原因還有待進一步研究。

圖6 kiss-1基因在牦牛和黃牛不同組織中的相對表達量

4 結論

本研究首次克隆出牦牛KISS-1基因，編碼區長408 bp，編碼135個氨基酸；與黃牛KISS-1核苷酸序列有7個位點的差異，其中5個導致氨基酸差異。KISS-1基因在牦牛和黃牛的下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮中均有表達，但在下丘腦和腦垂體的表達量高。

［1］ 張君, 余四九. 高原型牦牛繁育狀況及繁殖母牛體況調查［J］.畜牧與獸醫, 2005, 37（8）：21-22.

［2］ 楊效民, 張喜忠, 李迎光, 等. 黃牛發情規律觀察［J］. 中國牛業科學, 2006, 32（4）：12-15.

［3］ Lee JH, Miele ME, Hicks DJ, et al.KISS-1, a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene［J］. The Journal of the National Cancer Institute, 1996, 88（23）：1731-1737.

［4］ Choe HK, Kim HD, Park SH, et al. Synchronous activation of gonadotropin-releasing hormone gene transcription and secretion by pulsatile kisspeptin stimulation［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013, 110（14）：5677-5682.

［5］ Papaoiconomou E, Msaouel P, Makri A, et al. The role of kisspeptin/GPR54 in the reproductive system［J］. In Vivo, 2011, 25（3）：343-354.

［6］ 賴平, 王憑青, 張寶云, 等. 哺乳動物季節性繁殖的神經內分泌調節機制［J］. 遺傳, 2012, 34（3）：281-288.

［7］ Caraty A, Smith JT, Lomet D, et al. Kisspeptin synchronizes preovulatory surges in cyclical ewes and causes ovulation in seasonally acyclic ewes［J］. Endocrinology, 2007, 148（11）：5258-5267.

［8］ Sebert ME, Lomet D, Said SB, et al. Insights into the mechanism by which kisspeptin stimulates a preovulatory LH surge and ovulation in seasonally acyclic ewes：potential role of estradiol［J］. Domestic Animal Endocrinology, 2010, 38（4）：289-298.

［9］ Revel FG, Ansel L, Klosen P, et al. Kisspeptin：a key link to seasonal breeding［J］. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders, 2007, 8（1）：57-65.

［10］ Xu L, Xue H, Li S, et al. Seasonal differential expression ofKISS-1/GPR54 in the striped hamsters among different tissues［J］.Integrative Zoology, 2017, 12（3）：260-268.

［11］ Espigares F, Rocha A, Gómez A, et al. Photoperiod modulates the reproductive axis of European sea bass through regulation of kiss1 and gnrh2 neuronal expression［J］. General and Comparative Endocrinology 2017, 240：35-45.

［12］ Uenoyam Y, Pheng V, Tsukamura H, et al. The roles of kisspeptin revisited：inside and outside the hypothalamus［J］. Journal of Reproduction and Development, 2016, 62（6）：537-544.

［13］ Cielesh ME, McGrath BM, Scott CJ, et al. The localization of kisspeptin and kisspeptin receptor in the canine ovary during different stages of the reproductive cycle［J］. Reproduction in Domestic Animals, 2017, 52（Suppl. 2）：24-28.

［14］ Cao GL, Chu MX, Fang L, et al. Analysis on DNA sequence ofKISS-1gene and its association with litter size in goats［J］.Molecular Biology Reports, 2011, 38（6）：3839-3848.

［15］ Chen Y, Liu L, Li Z, et al. Molecular cloning and characterization of kiss1 in Brandt’s voles（Lasiopodomys brandtii）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology, Part B：2017, 208-209：68-74.

［16］ Shahi N, Singh AK, Sahoo M, et al. Molecular cloning,characterization and expression profile of kisspeptin1 and kisspeptin1 receptor at brain-pituitary-gonad（BPG）axis of golden mahseer, Tor putitora（Hamilton, 1822）during gonadal development［J］. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 2017, 205：13-29.

［17］ Jeon YE, Lee KE, Jung JA, et al. Kisspeptin, leptin, and retinolbinding protein 4 in women with polycystic ovary syndrome［J］.Gynecol Obstet Invest, 2013, 75（4）：268-274.

［18］ Sonigo C, Bouilly J, Carré N, et al. Hyperprolactinemia-induced ovarian acyclicity is reversed by kisspeptin administration［J］.The Journal of Clinical Investigation, 2012, 122（10）：3791-3795.

［19］ Wahab F, Atika B, Shahab M. Kisspeptin as a link between metabolism and reproduction：evidences from rodent and primate studies［J］. Metabolism, 2013, 62（7）：898-910.

［20］ An XP, Ma T, Hou JX, et al. Association analysis between variants in KISS1 gene and litter size in goats［J］. BMC Genetics, 2013,14（1）：63.

［21］ El-Tarabany MS, Zaglool AW, El-Tarabany AA, et al. Association analysis of polymorphism in KiSS1 gene with reproductive traits in goats［J］. Animal Reproduction Science, 2017, 180：92-99.