鱘魚外周血淋巴細胞的分離及最佳體外增殖性反應條件

董穎 胡紅霞 田照輝 王巍 東天

（北京市水產科學研究所暨國家淡水漁業工程技術研究中心 漁業生物技術北京市重點實驗室，北京 100068）

淋巴細胞體外增殖性反應是衡量機體細胞免疫能力的一個重要測定指標，對研究免疫機理、診斷及藥物選擇方面具有重要作用［1］。分離獲得有活力的淋巴細胞是進行此項研究的先決條件。不同物種淋巴細胞的增殖條件不盡相同，影響淋巴細胞增殖的主要因素有細胞培養時間、培養溫度、細胞培養初始密度、胎牛血清濃度及絲裂原的種類和濃度等。目前，關于鱘魚外周血淋巴細胞的分離和體外增殖條件的研究尚未見報道。

本研究探索了不同濃度Percoll分離液對鱘魚外周血淋巴細胞的分離效果。分別以植物血凝 素（Phytohaemagglutinin，PHA）、 刀 豆 蛋 白 A（Concanavalin A，ConA）和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）作為淋巴細胞增殖絲裂原，采用L25（56）五因素五水平正交試驗設計［2］，用Cell Counting Kit-8法（CCK-8或WST-8）對鱘魚外周血淋巴細胞的培養時間、培養溫度、細胞密度、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）濃度及絲裂原濃度等因素進行探索性研究，以探討鱘魚外周血淋巴細胞增殖性反應的最佳條件，為進行鱘魚免疫功能的檢測及染色體分析等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的小體鱘（Acipenser ruthenus），由北京市水產科學研究所房山十渡國家級鱘魚良種場提供。

1.2 方法

1.2.1 鱘魚外周血淋巴細胞的分離 用無菌注射器吸取1%滅菌肝素鈉溶液，實驗魚尾部消毒后，尾靜脈抽血（血液∶肝素鈉溶液=1∶1），將注射器針頭灼燒滅菌后，套上針帽，顛倒混勻。分別取55%、60%、65%和70%的Percoll液（比重分別為1.075、1.080、1.086和1.092 g/mL）2 mL 于15 mL無菌離心管中，在上面小心加入各4 mL抗凝血（血液：肝素鈉溶液=1∶1），使用水平轉子500×g離心30 min。取中間渾濁含淋巴細胞層加入適量RMPI-1640培養液（含10 000 IU/mL青霉素+10 000 μg/mL鏈霉素）中。0.4%臺盼藍染色觀察細胞活性，吉姆薩染色檢測淋巴細胞純度，光學顯微鏡下觀察并計數。

1.2.2 正交試驗設計 分別選用PHA、ConA、LPS作為淋巴細胞增殖絲裂原，對培養時間、培養溫度、細胞密度、胎牛血清濃度及絲裂原濃度這5個水平進行正交試驗，采用L25（56）正交試驗設計表，具體試驗設置見表1。

表1 鱘魚外周血淋巴細胞體外增殖反應正交試驗設計

1.2.3 鱘魚外周血淋巴細胞增殖反應的測定 按照正交試驗設計，在96孔細胞培養板（康寧）中加入100 μL不同的細胞培養液，每個試驗組設置4個重復，同時設置空白對照組，置于不同溫度的培養箱中進行培養。依照增強型CCK-8試劑盒（碧云天，批號：C0043）使用說明，在每孔中加入10 μL增強型CCK-8溶液，繼續孵育2 h，用酶標儀在450 nm測定吸光度（OD值）。

1.2.4 數據處理 依據下列公式計算細胞刺激指數（Stimulating index，SI），用來評價淋巴細胞的增殖能力。使用軟件Excel和SPSS 19進行數據處理。

SI=（OD試驗組-OD對照組）/OD對照組×100%

2 結果

2.1 鱘魚外周血淋巴細胞的分離

水平離心后離心管內液體明顯分為4層，包括最上層略偏黃色的血漿層，第2層灰白呈膜狀的淋巴細胞富集層，第3層無色透明的淋巴細胞分離液層，以及最下層紅色的紅細胞堆積層。通過比較不同濃度Percoll液對小體鱘外周血淋巴細胞的分離效果（表2）發現，70%的Percoll液（比重為1.092 g/mL）的分離效果最佳，淋巴細胞富集層分界面明顯，且淋巴細胞回收率最高，平均回收率為89.62+8.08%。

2.2 鱘魚外周血淋巴細胞的制備

使用70%的Percoll液分離小體鱘外周血淋巴細胞，并用適量RMPI-1640進行稀釋，細胞濃度為1.45×107個/mL。0.4%臺盼藍染色觀察其中活細胞數為99%以上，吉姆薩染色檢測淋巴細胞純度為98%以上。

2.3 鱘魚外周血淋巴細胞增殖反應條件的確定

分別選用PHA、ConA、LPS作為淋巴細胞增殖絲裂原，對培養時間、培養溫度、細胞密度、胎牛血清濃度及絲裂原濃度進行5因素5水平的正交試驗，結果見表3。

表2 不同密度淋巴細胞分離液的分離效果

對上述結果進行直觀和方差分析，表明PHA、ConA、LPS這3種淋巴細胞增殖絲裂原對鱘魚外周血淋巴細胞的增殖反應差異不顯著。F檢驗表明細胞量與試驗誤差之間的差異極顯著（P＜0.01）。經極差分析可知，PHA作為絲裂原時，各因素對試驗結果影響的主次順序依次為：細胞量＞PHA＞溫度＞FBS＞時間（圖1）；ConA作為絲裂原時，各因素對試驗結果影響的主次順序依次為：細胞量＞時間＞ConA＞FBS＞溫度（圖2）；LPS作為絲裂原時，各因素對試驗結果影響的主次順序依次為：細胞量＞LPS＞ 溫度 ＞FBS＞ 時間（圖 3）。

綜合上述結果，篩選出鱘魚外周血淋巴細胞體外增殖反應最佳條件為：3.625×106初始細胞量、20 μg/mL 的 PHA 或 50 μg/mL 的 ConA 或 10 μg/mL的LPS作為絲裂原、10%-20% FBS、20-25℃培養2 d。

3 討論

淋巴細胞參與特異性免疫反應，在免疫應答中起主要作用。魚類的淋巴細胞是白細胞中數量最多的一類，通常占白細胞總量的90%左右［3］。常見的外周血淋巴細胞分離方法包括自然沉降法和密度梯度離心法，前者具有操作簡便、不受儀器設備的限制等優點，但其分離速度慢且獲得的淋巴細胞純度較低；而后者可獲得高純度的淋巴細胞，但需要水平離心機等設備及相應試劑。分離不同物種外周血中的淋巴細胞需要使用不同比重的分離液，如人類為 1.077 g/mL、小鼠為 1.092 g/mL、豬為 1.110 g/mL［4］。陳全震等［5］的研究表明使用1.080-1.085 g/mL的Ficoll-Urografin分離液可將草魚外周血中的淋巴細胞全部分離出來。謝昆等［6］的研究表明使用1.085 g/mL的淋巴細胞分離液可有效分離鯽魚、鯉魚和草魚的外周血淋巴細胞。本研究發現70% Percoll液（比重1.092 g/mL）具有更好的分離效果，淋巴細胞富集層分界面明顯，且淋巴細胞回收率最高，是進行鱘魚外周血淋巴細胞分離的理想介質。

用于檢測淋巴細胞增殖的方法主要有形態學方法、H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法、MTT 法和CCK-8法等。形態學方法簡便易行，但其重復性和客觀性較差，不適用于大量樣本的檢測；3H-TdR摻入法雖然靈敏度高、特異性強、穩定性好，但操作步驟多，且存在放射性危害；MTT法因具有簡便、經濟、安全等特點而被廣泛使用，但其操作較繁瑣，需加入DMSO溶解甲臜晶體，可能遇到顆粒

不完全溶解且在吸取上清的操作中也極易帶走部分細胞，導致結果穩定性和重復性較差［7］。CCK-8法（Cell counting Kit-8）是一種基于WST-8而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒［8］。該方法已經成功用于雞［9］、小鼠［10］和人［11］等的淋巴細胞增殖試驗中，但在魚類淋巴細胞增殖研究中的應用還比較少見。本研究表明增強型CCK-8試劑盒同樣適用于對鱘魚淋巴細胞增殖進行測定。

表3 鱘魚外周血淋巴細胞體外增殖反應正交試驗結果

續表

圖1 鱘魚外周血淋巴細胞在PHA作用下的正交試驗結果

圖2 鱘魚外周血淋巴細胞在ConA作用下的正交試驗結果

與哺乳動物類似，魚類淋巴細胞有T淋巴細胞和B淋巴細胞等類型，其中T淋巴細胞主要介導細胞免疫并在免疫應答中起調節作用，而B淋巴細胞在體液免疫中參與抗體的合成［3］。常用的引起淋巴細胞增殖性反應的有絲分裂原有PHA、ConA和LPS等，其中PHA和ConA可促進T淋巴細胞分裂，LPS可促進B淋巴細胞分裂［12］。大量研究表明，不同絲裂原對不同魚類淋巴細胞體外增殖的刺激效果不同，如PHA適用于鯉魚［13］和羅非魚［14］等的淋巴細胞增殖，ConA 適用于虹鱒［15］、牙鲆［16］和石鰈［17］等的淋巴細胞增殖，LPS適用于半滑舌鰨［18］等的淋巴細胞增殖。本研究中分別使用PHA、ConA和LPS作為絲裂原，并采用了3個L25（56）正交試驗表對3種絲裂原的培養濃度、細胞培養時間、培養溫度、細胞培養初始密度和胎牛血清濃度這5個對淋巴細胞體外培養影響較大的因素進行分析，獲得了鱘魚外周血淋巴細胞體外增殖的最佳條件為：3.625×106初始細胞量、20 μg/mL的PHA或50 μg/mL的ConA或10 μg/mL的LPS作為絲裂原、10%-20%胎牛血清（FBS）、20-25℃培養 2 d。

圖3 鱘魚外周血淋巴細胞在LPS作用下的正交試驗結果

4 結論

本研究以小體鱘為研究對象，以70%的Percoll液（比重為1.092 g/mL）作為淋巴細胞分離液的分離效果最佳。分別使用PHA、ConA和LPS作為絲裂原，獲得鱘魚外周血淋巴細胞體外增殖的最佳條件為：3.625×106初始細胞量、20 μg/mL的PHA或50 μg/mL的 ConA 或 10 μg/mL的 LPS作為絲裂原、10%-20%胎牛血清（FBS）、20-25℃培養2 d。

［1］楊漢春. 動物免疫學［M］. 第2版. 北京：中國農業出版社,2004.

［2］ 劉瑞江, 張業旺, 聞崇煒, 等. 正交試驗設計和分析方法研究［J］. 實驗技術與管理, 2010, 27（9）：52-55.

［3］林浩然. 魚類生理學［M］. 第1版. 廣州：中山大學出版社,2011.

［4］張素華, 林丹丹, 張美娟, 等. Ficoll密度梯度離心法分離豬外周血單個核細胞條件的探討［J］. 中國血吸蟲病防治雜志,2007, 19（3）：192-195.

［5］ 陳全震, 李亞南, 邵健忠. 魚類外周血淋巴細胞的分離技術［J］.中國水產科學, 1999, 6（4）：10-12.

［6］謝昆, 黃民昆. 魚類外周血淋巴細胞的分離和體外培養［J］.黑龍江畜牧獸醫, 2011（3）：138-142.

［7］Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：Application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.Journal of Immunological Methods, 1983, 65（1-2）：55-63.

［8］Tominaga H, Ishiyama M, Ohseto F, et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay［J］.Analytical Communications, 1999, 36（2）：47-50.

［9］劉素貞, 曹曉敏, 等. 應用CCK8法檢測雞淋巴細胞活性的檢測最佳條件研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫, 2017（13）：212-214.

［10］王園園, 譚小燕, 胡明華, 等. CCK-8法檢測小鼠淋巴細胞增殖的條件探討［J］. 藥物評價研究, 2017, 40（2）：206-209.

［11］張娜, 封穎璐. 刀豆球蛋白A刺激對人外周血T淋巴細胞的增殖作用［J］. 臨床醫學工程, 2016, 23（2）：155-157.

［12］ 肖克宇. 水產動物免疫與應用［M］. 第1版. 北京：科學出版社, 2007.

［13］耿波, 梁利群, 孫效文. 鯉魚血淋巴細胞培養及染色體制備條件探索［J］. 水產學雜志, 2003, 16（2）：32-34.

［14］曹麗萍, 丁煒東. 半微量全血培養法制備羅非魚染色體標本的條件探索［J］. 上海海洋大學學報, 2005, 14（4）：457-459.

［15］Tillitt DE, Giesy JP, Fromm P O. In vitro mitogenesis of peripheral blood lymphocytes from rainbow trout（Salmo gairdneri）［J］.Comparative Biochemistry & Physiology A Comparative Physiology,1988, 89（1）：25-35.

［16］朱香萍, 林明敏, 李楨, 等. 牙鲆外周血淋巴細胞的培養及染色體制備條件的探討［J］. 青島農業大學學報：自然科學版,2007, 24（4）：253-256.

［17］林明敏, 朱香萍, 李美玉, 等. 石鰈外周血細胞的培養及染色體制備條件的探討［J］. 青島農業大學學報：自然科學版,2009, 26（4）：325-329.

［18］張博, 王賢麗, 楊長庚, 等. 半滑舌鰨血淋巴細胞體外培養及其染色體制備在性別鑒定中的應用［J］. 水生生物學報,2011, 35（3）：430-435.