菘藍內生細菌的分離、篩選和鑒定

王霞 薛林貴 張曉華 何小燕 范桃桃 尚海

（1. 蘭州交通大學化學與生物工程學院 甘肅省極端環境微生物資源與工程重點實驗室，蘭州 730070；2. 蘭州交通大學環境與市政工程學院，蘭州 730070）

植物內生菌是指生活史中某一階段或整個階段定植在植物各組織器官或細胞間隙內的一類對自身植物不引起明顯病害癥狀的一類微生物群，其包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌等［1-2］。它們具有豐富的生物多樣性、宿主植物種類多樣性及功能多樣性［3］。這些菌株對植物本身具有促生長、生物防治、增強抗逆性及生物修復等多種有益的生物學功能［4-7］。研究表明，內生菌與宿主之間建立了十分密切的生態關系，參與植物次級代謝產物的合成與轉化，并且由于協同進化中基因的橫向轉移與交換，內生菌還會獲得與宿主相同的部分代謝途徑，合成與宿主相同或相似的次生代謝產物［8-9］。由于化學農藥使用存在殘留、引發植物病原菌抗性和再猖獗等隱患，近年來從藥用植物中分離篩選具有生防作用的內生菌以研發生物農藥成為一個新興的研究熱點［10-11］。因此，從植物中發掘有益微生物資源具有廣闊前景。

菘藍（Isatis indigotica），以根入藥又稱板藍根，十字花科（Cruciferae），菘藍屬，兩年生草本植物，是應用廣泛的大宗藥材，主產于河北、浙江、安徽、河南及河西走廊等地。菘藍性寒，味苦，主歸心，多被用于治療病毒性感冒、腮腺炎、濕病發熱、風熱感冒、咽喉腫痛、流行性乙肝型腦炎及肝炎等［12-13］。

近年來，有關于菘藍的栽培技術、化學成分、藥理活性、生物學特性及中藥材質量評價的研究較多，但目前有關菘藍內生菌的研究未見報道。本研究以從菘藍的根、莖、葉、葉柄和花中分離出的內生細菌為材料，從微生物的培養、形態及生理生化指標、分子生物學鑒定和抑菌性入手，探討菘藍中內生細菌對植物病原菌的抗菌作用，旨為菘藍的進一步開發利用和探尋有效拮抗微生物資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品菘藍：采自甘肅省張掖市山丹縣位奇鎮四壩村菘藍大田種植田，樣品采集后用自封袋密封后馬上回實驗室進行內生菌的分離。

供試菌株：禾谷鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、大斑凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、鏈格孢霉（Alternaria alternata）均來自于河西學院微生物生理生化實驗室惠贈。

1.2 方法

1.2.1 內生菌的分離純化 將采集的鮮菘藍植株的根、莖、葉、葉柄和花放在自來水中沖洗干凈，分別將根、莖和葉柄截成 1-1.5 cm 長，放入無菌廣口瓶。置于超凈工作臺紫外滅菌。采用朱士茂報道的表面消毒方法［14］對菘藍的根、莖、葉、葉柄和花進行表面滅菌。用無菌蒸餾水沖洗已表面滅菌后的材料，然后將此液體移入培養基中，培養觀察是否滅菌徹底。在超凈工作臺上用無菌鑷子挑取經預處理和表面滅菌的根莖放在無菌培養皿中，將其剝皮，用無菌小刀縱切表皮，中間部分切成0.5 cm×0.5 cm大小，插入牛肉膏蛋白胨培養基中。再用無菌鑷子挑取處理過的葉、葉柄和花各1 g，放于無菌的盛有石英砂的研缽進行研磨，并用無菌水制成溶液涂布在牛肉膏蛋白胨培養基上于37℃恒溫培養 24 h（以上每種均接3個平皿），待菌落長出后，根據菌落大小、形態、顏色進行初步篩選，反復劃線分離，純化菌株冷藏保存。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 采用同步培養法將內生細菌用劃線法接種于平板培養基中，然后迅速以無菌操作將滅菌的牛津杯（直徑為0.5 cm）放置于有禾谷鐮刀菌、大斑凸臍蠕孢和鏈格孢菌的培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，接種在之前內生細菌培養基中于28℃恒溫培養，5 d后測定內生細菌的抑菌活性。以只接病原真菌為對照，3次重復，計算抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5 cm）× 100%。

1.2.3 拮抗菌株的菌落特征及生理生化反應 參照《微生物學實驗》［15］對篩選的拮抗菌在培養基上采用劃線法劃出單菌落，記錄菌落的形態、顏色、透明度等，顯微鏡下觀察細菌的形態特征及革蘭氏染色反應。參考《常見細菌系統鑒定手冊》［16］對篩選的內生菌菌株進行生理生化反應的測定。

1.2.4 16S rRNA分子生物學鑒定 將篩選的拮抗內生菌株采用高鹽法提取菌體的染色體總DNA。以菌株的總DNA為模板，使用通用引物來擴增降解菌株的16S rRNA基因。5'端引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（Escherichia colibases 8-27），3'端引物為 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（E. colibases 1507-1492）。50 μL 的 反 應 體 系 ：10×Buffer 5.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL，引物（1 mmol/L）各 1.0 μL，DNA模 板（50.0 ng/μL）1.0 μL，Taq 酶（5.0 U/μL）0.5 μL，超純水 33.5 μL。PCR 反應條件 ：94℃預變性2 min，進入熱循環：94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環；最后72℃延伸10 min。取PCR產物于0.75%的瓊脂糖凝膠上電泳。根據試劑盒操作說明進行。回收DNA片段并電泳檢測其純度。將回收后的DNA片段用pMD18-T通用測序引物測序［17］，序列測定工作委托上海生工生物工程有限公司完成。根據基因的測序結果，將其 序 列 EzTaxon-eserver（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）數據庫中基因序列進行同源性比較［18］，采用CLUSTAL_X將菌株的基因序列與其同源關系相近的序列比對分析后，把兩頭的序列剪切整齊，用MEGA version 6.0軟件轉換格式后，采用鄰近法構建系統進化樹［19-20］。

2 結果

2.1 菘藍內生菌的分離純化

通過微生物學傳統分離純化的方法從菘藍的根、莖、葉、葉柄和花中分別分離到7、5、5、2及0株內生細菌，其中以根中的細菌數量最多。

2.2 菘藍內拮抗菌株的篩選

以大斑凸臍蠕孢等3種植物病原真菌作為靶標菌，對分離到的19株內生細菌進行拮抗作用測定（圖1），如表1，有10株菌對植物病原菌禾谷鐮刀菌有不同程度的抑制作用，占分離菌總數的52.6%，抑菌率從19.96%到 94.63%，其中G2對禾谷鐮刀菌的抑菌效果最強，抑菌率為94.63%；19株內生細菌對鏈格孢霉，大斑凸臍蠕孢均有很強的抑制作用，占分離菌總數的100%，其中菌株G2、J1、Y5及B2對鏈格孢霉，大斑凸臍蠕孢的抑菌率最大均接近100%，整體來看，從菘藍中所分離的19株內生細菌具有較好的抑菌作用。

2.3 篩選菌株的初步鑒定

對3種病原菌抑制作用較強的菌株G2、J1、Y5和B2 進行平板培養，經48 h培養觀察，平板菌落特征為：菌落均濕潤、不透明、易挑起、生長速度快，菌落正反面顏色一致，菌落邊緣不整齊或呈缺刻狀。菌株J1、Y5的菌落扁平狀，有光澤，黃色，菌株G2菌落圓形、稍凸起、橙黃色、有粘性，菌株B2菌落淺黃色，邊緣光滑凸起。根據細胞形態特征和生理生化特性試驗如表2，結合東秀珠等編的《常見細菌系統和鑒定手冊》［16］，菌株G2被初步鑒定為庫克菌屬（Kocuria）菌株；菌株J1、Y5被初步鑒定為微桿菌屬（Microbacterium）菌株；菌株B2被初步鑒定為短狀桿菌屬（Brachybacterium）菌株。

圖1 菘藍內生菌的拮抗菌篩選結果

2.4 拮抗菌株總DNA的提取

拮抗菌株G2、J1、Y5和B2的基因組DNA提取結果見圖2，基因組DNA在電泳圖上的23 130 bp附近一條明顯的條帶，可以用于PCR擴增。

2.5 篩選菌株的系統進化分析結果

將菌株G2、J1、Y5和B2的基因序列提交到GenBank，將該基因序列在EzTaxon-e server進行比較（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/）發現，菌株B2與模式菌株Brachybacterium ginsengisoliDCY80（T）有最大的序列相似性，為98.28%，G2與模式菌株Kocuria roseaDSM 20447（T）有最大的序列相似性，為99.16%；菌株J1和Y5與模式菌株Microbacterium maritypicumDSM 12512（T）有最大的序列相似性，分別為99.36%和99.14%，用MEGA version 5.0軟件包中的Kimura-Parameter Distance 模型計算進化距離，用Neighbor-Joining構建系統進化樹，如圖3，1 000次隨機抽樣，計算自引導值（Bootstrap）以評估系統進化樹的置信度。結合菌株細胞形態及生理生化指標鑒定菌株B2為人參短狀桿菌（Brachybacterium ginsengisoli）；菌株G2為玫瑰色庫克菌（Kocuria rosea）；菌株J1，Y5為微桿菌屬的黃桿菌（Microbacterium maritypicum）。

表1 內生細菌對3種植物病原菌的抑菌效果

表2 菌株G2、J1、Y5和B2的生理生化試驗結果和細胞特征

3 討論

本試驗共從采自于張掖的菘藍中分離得到19株內生細菌，經過篩選得到4株拮抗性較高的內生細菌，基于16S rRNA全序列的系統發育分析及生理生化顯示，供試菌株分屬于3個菌屬4個種。其中2個屬于微桿菌屬，1個屬于庫克菌屬，1個屬于短狀桿菌屬。本研究從菘藍根、莖、葉、葉柄和花中分離出不同的內生細菌，結果僅在菘藍根、莖、葉、葉柄中分離出數量有限的內生細菌，這與其他一些關于內生菌分離的結果并不一致，結果可能是采集樣本的數量有限，樣本來源地較為單一所導致。在試驗過程中，我們以最后一次表面沖洗的無菌水作為陰性對照，并未在其中發現可培養的任何細菌，說明整個操作過程消毒嚴密，這些內生菌并不是從空氣、土壤及其他環境因素中帶入，或者是試驗條件所致的不可培養微生物的丟失。在以后的研究中，我們會探索其他的培養和檢測方法，以期更為真實的揭示內生細菌的遺傳多樣性信息。

圖2 菌株G2、J1、Y5和B2的基因組DNA及16S rRNA基因的PCR擴增產物

圖3 篩選菌株的16S rRNA序列的系統發育樹

分離結果中發現的菌株既有病原菌，也有非病原菌：黃桿菌革蘭氏陽性菌，是從海水和海洋泥漿中分離出來的，該菌耐極端環境，參與核黃素代謝，是一種機會性致病菌，會引起食源性疾病［21-23］，但該菌株抑菌性未見報道，常見的微桿菌屬的抑菌性報道有氧化微桿菌等［24-26］。人參短狀桿菌是Hoang 等［27］首次從韓國人參田土壤中分離到的新型菌株，其能產生鐵載體并對青霉素G、紅霉素、萬古霉素、四環素、利福平和新霉素具有敏感性，海洋細菌是潛在有用的抗菌分子的豐富來源；Liu等［28］從廣東湛江硇洲島褐籃子魚的胃腸道中分離篩選到19株拮抗菌，其中包括短狀桿菌ZJHD5-23發現，其對大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））、白色念珠菌（Candidia albicans）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）具有不同程度的抑制作用，表現出良好的抗菌譜。短狀桿菌在內生拮抗菌中占據比例很少，一般大多數關于短狀桿菌的報道有環境污染物的降解［29-30］、耐金屬性［31］、產酶特性［32］等。玫瑰色庫克菌屬，一般從土壤和水中分離，對多黏菌、夾竹桃霉素、卡那霉素、萬古霉素和鏈霉素等敏感，對溶菌酶有輕微的抗性［33］，具有耐極端環境［34］和很好的腐殖質還原特性［35-36］。該菌株通常定殖于口咽、皮膚和黏膜的非致病性共生體，一般在免疫功能低下的患者中引起機會性感染，目前常見的病例有壞死性縱隔炎、心內膜炎和腦膜炎［37-39］。據報道［40］該菌株對植物病原真菌灰霉病（Botrytis cinerea）、西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp.niveum）、 玉 米 赤 霉（Gibberella zeae）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、柿樹炭疽菌（Colletotrichum gloesporioides）和細菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginos）具有很強的抑制作用。

這些菌株中，只有玫瑰庫色克菌是傳統意義上的病原菌，而其余均為具有特殊生物學屬性的細菌，體現在對環境的適應能力、參與地球化學物質循環、產生促生作用和良好的抗菌效果等方面。因此，我們猜測，在菘藍中分離得到的這些內生細菌，與菘藍本身具有的良好抗菌效果之間有一定的關聯，可能是內生菌菌株在長期進化中獲得了植物本身的部分特性，以適應特殊的生存環境，達到與植物共進化的目的。本試驗選取的3個病原菌均為河西走廊制種玉米生育中的常見、多發性病害。目前對其防治主要采用化學方法，而本實驗中所有供試菌株對其中的兩種主要病原菌均具有良好的抗性作用，尤其是從菘藍中篩選的內生菌菌株G2、J1、Y5和B2對這些植物病害有有效的拮抗作用。內生菌的生防效果及其應用有待后續進一步研究，這將為進一步利用內生菌制備良好的生物制菌肥或菌劑及新藥物的開發奠定一定的理論基礎。

4 結論

本研究從藥用植物菘藍中共分離到19株內生細菌，并發現它們對河西走廊3種常見植物病原真菌有不同程度的抗菌作用；10株細菌對禾谷鐮刀菌有不同程度的抑制作用，占分離菌總數的52.6%，其中菌株G2對禾谷鐮刀菌的抑菌效果最強，抑菌率為94.63%；19株細菌均對鏈格孢霉、大斑凸臍蠕孢有不同程度的抑制作用，占分離菌總數的100%。其中菌株G2、J1、Y5和B2對這兩種病原菌的抑菌率最大，均接近100%。經形態學觀察、生理生化檢測及16S rRNA序列分析，菌株G2為玫瑰色庫克菌；菌株J1、Y5為黃桿菌；菌株B2為人參短狀桿菌。［1］Suhandono S, Kusumawardhani MK, Aditiawati P. Isolation and

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