戈壁異常球菌Dgl5蛋白生物學功能研究

張亨 劉盈盈 陳云 平淑珍 王勁

（1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621000；2. 中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

高鹽、低溫等環境因素會導致細胞內水分的大量流失，嚴重影響生物體正常的生長代謝。自然界中很多生物通過調節脅迫應答基因的表達量來減弱這類非生物脅迫的影響［1］。植物胚胎發育晚期豐富蛋白（Late embryogenesis abundant，LEA）在響應非生物脅迫中起重要作用［2-4］，通常以分子伴侶的形式保護細胞內生物大分子不受損傷［5-7］。Battaglia等［8］根據LEA蛋白保守氨基酸序列及親疏水性將其分為7個家族。其中LEA1、2、3、4、6、7家族蛋白都是典型的親水蛋白，在天然狀態下都具有重復的保守基序（motifs）且高度親水。而LEA5家族蛋白缺少明顯的motifs而且具有較高的疏水特性［9］。LEA5進一步又可以分為5A（SMP）、5B（LEA_3）、5C（LEA_2）3個亞類。其中LEA5C亞類因含有一個“WHy（Water Stress and Hypersensitive response，WHy）”結構域而備受關注［10］。LEA5C蛋白最早發現于植物中，且研究工作集中在序列比較、性質預測、分子鑒定、異源表達等方面。已有研究表明來源于植物的LEA5C與生物體逆境脅迫相關，具有類似分子伴侶的功能［11］。如He等［9］將水稻的LEA5C家族蛋白OsLEA5在大腸桿菌中過量表達，發現其能提高大腸桿菌對高鹽和冷凍等脅迫的抗性；體外實驗顯示，在反復凍融處理條件下OsLEA5蛋白能夠保護乳酸脫氫酶（LDH）活性。到目前為止，除大部分植物來源的LEA5C蛋白外，在細菌和古細菌中也發現了該類蛋白的存在［12］。但關于細菌和古細菌來源的LEA5C蛋白的功能研究大部分是對宿主的抗逆表型進行分析，其抵抗非生物脅迫的分子機理報道較少，與植物來源的LEA5C蛋白是否一樣擁有類似分子伴侶的功能有待研究。

耐輻射微生物對氧化、高鹽和UV射線等具有極強抗性，能在高溫、嚴寒及干燥等極端逆境下生存，具有非凡的適應機制以抵抗極端環境造成的損傷［13］。已有研究報道，來自耐輻射異常球菌（Deinococcus radioduransR1） 的 LEA5C家 族蛋白DrwH可以通過保護蘋果酸脫氫酶（Malate dehydrogenase，MDH） 及 乳 酸 脫 氫 酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的活性并且能夠增強大腸桿菌氧化脅迫抗性［14］。本研究室從新疆戈壁極端環境分離到一株耐輻射細菌-戈壁異常球菌（Deinococcus gobiensisI-0）［15］。 基 因 組 序 列 分 析 顯 示 該 菌 中Dgo_CA1605基因編碼的蛋白與LEA5C家族蛋白序列具有相似性，為此本研究將該蛋白命名為Dgl5（Deinococcus gobiensisLEA5C protein，Dgl5）。本研究通過構建Dgl5蛋白表達載體，進行外源表達與純化，探索非生物脅迫下Dgl5蛋白對大腸桿菌生長的影響，并在體外逆境條件下測定Dgl5對MDH和LDH酶活的保護作用，為了解耐輻射戈壁異常球菌極端抗性機制及LEA5C蛋白的分子機理奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質粒和培養條件 野生型戈壁異常球菌（Deinococcus gobiensisI-0）為本實驗室保存；高頻轉化受體菌大腸桿菌Escherichia coliTop10及表達菌株E. coliBL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；質粒 pET28a 及pGEX4T-2由本實驗室保存。大腸桿菌于 LB 培養基（1% Typtone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH 7.0，固體培養基含 1.5%瓊脂）中37℃條件下培養。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶、BSA購于 New England Biolabs 公司；細菌基因組提取試劑盒、常規質粒提取試劑盒及膠回收純化試劑盒購自 Magen公司；MDH、LDH、草酰乙酸、NADH購于Sigma Aldrich公司；無縫克隆試劑盒購自北京中美泰和生物技術有限公司；其他生化試劑均為分析純。引物合成和基因測序均由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 Dgl5蛋白生物信息學分析 從NCBI中獲取戈壁異常球菌基因Dgo_CA1605的序列及所編蛋白的氨基酸序列信息。利用Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線預測Dgl5蛋白的分子質量、等電點、總平均親水指數及各種氨基酸含量等基本性質；利用Protscale（http：//web.expasy.org/protscale/），結合Kyte等總結出的氨基酸疏水指數，進行Dgl5蛋白親疏水性分析；利用Cspritz（http：//protein.bio.unipd.it/cspritz/）對蛋白進行無序特征預測；利 用 SMART（http：//smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）對蛋白質結構域進行分析。利用DNAMAN進行多序列比對并構建進化樹。

1.2.2 重組E. coli菌株的構建 從NCBI中獲取Dgo_CA1605的序列。根據同源重組的方法設計引 物 F1（5'-3'）：CAGCAAATGG GTCGCGGATC CATGCAGGTG CCCACCGTGC A ；R1（5'-3'）：TCGAGTGCGG CCGCAAGCTT GTCAGAAGGG CAGGATGGCC GC，并由華大基因有限公司合成。以D. gobiensisI-0基因組DNA為模板，使用F1/R1引物擴增目的片段，擴增產物長度為465 bp。PCR反應條件是：95℃預變性5 min；95℃變性 30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸5 min。同時用BamH I和Hind III 37℃酶切pET28a質粒2 h。瓊脂糖凝膠電泳確定片段及酶切產物正確后回收。用無縫克隆試劑50℃連接20 min，之后將連接產物轉化E. coliTop10，在含有50 μg/mL Kan的LB平板上篩選，獲得陽性轉化子并測序。提取測序正確的重組質粒，轉化表達菌株BL21（DE3）獲得重組菌株 BL21（pET28a-Dgl5）。同樣的方法構建重組菌株BL21（pGEX4T-2-Dgl5），用于表達含有GST-tag的融合蛋白GST-Dgl5。引物如下：

F2（5'-3'）：CTGTTCCAGG GGCCCCATAT GATGCAGGTG CCCACCGTGC A；

R2（5'-3'）：ATGATGATGA TGATGCTCGA GTCAGAAGGG CAGGATGGCC GC。

1.2.3 重組E. coli菌株非生物脅迫實驗 將實驗的重組菌株及對照菌株在LB平板上分別劃線過夜培養，從活化的平板上分別挑取單菌落于5 mL新鮮的液體LB培養基（50 μg/mL Kan）中37℃過夜培養，按初始OD600為0.1分別接種于20 mL新鮮的液體LB 培養基中（50 μg/mL Kan），培養 30 min 后加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG 于培養基中，連續培養至菌液OD600約為0.6，分別取出1 mL菌液進行如下脅迫處理：（1）鹽脅迫：將上述1 mL菌液進行10倍梯度稀釋（10-1-10-5），每個稀釋度各取6 μL點在含有500 mmol/L NaCl的固體LB培養基表面，經37℃培養約48 h左右，觀察菌落形成情況。（2）冷凍脅迫：將上述1 mL菌液進行反復凍融處理（-80℃冷凍20 min 室溫融化20 min為一次反復凍融循環），處理后立即進行10倍梯度稀釋（10-1-10-5），每個稀釋度各取6 μL點在固體LB培養基表面，經37℃培養約16 h左右，觀察菌落形成情況。（3）氧化脅迫：將上述1 mL菌液中分別加入終濃度為20 mmol/L 30% H2O2，處理15 min后立即進行10倍梯度稀釋（10-1-10-5），每個稀釋度各取10 μL點在固體LB培養基表面，經37℃培養約16 h左右，觀察菌落形成情況。上述脅迫實驗分別進行3次獨立實驗，確定菌株的非生物脅迫表型。

1.2.4 Dgl5蛋白表達與純化 將重組菌株E. coli菌株（E. colipGEX4T-2-Dgl5/BL21）活化后挑取單菌落于20 mL新鮮的液體LB培養基（50 μg/mL Amp）中37℃過夜培養，之后按初始OD600為0.1接種于1 000 mL含Amp的新鮮LB液體培養基中，37℃培養至菌液OD600約為0.6，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，16℃連續培養15 h。6 000 r/min離心8 min收集菌體，用30 mL裂解Buffer（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L K2HPO4，pH 7.3）重懸菌體，超聲破碎細胞，14 000 r/min、50 min離心收集上清。將上清倒入用裂解Buffer平衡好的親和層析柱中，并用裂解Buffer洗去雜蛋白，最終用洗脫Buffer（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L 谷胱甘肽還原酶，pH 8.0）洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測蛋白純化情況，并采用Brandford法測定蛋白濃度。

1.2.5 液氮反復凍融脅迫條件下MDH和LDH酶活測定 本實驗通過檢測A340變化評估MDH與LDH活性。所用緩沖液如下：MDH酶溶解液（50 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，pH 7.2），MDH反應液（0.2 mmol/L草酰乙酸、0.2 mmol/L NADH、150 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 7.5）；LDH酶溶解液（25 mmol/L Tris-HCl，pH7.2），LDH 反 應 液（100 mmol/L KCl、2 mmol/L 丙酮酸鈉、0.15 mmol/L NADH、25 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）。為測定Dgl5蛋白在液氮反復凍融條件下對MDH和LDH酶活性的保護作用，按照MDH與蛋白1∶2.5的摩爾比；LDH與蛋白1∶2的摩爾比混合樣品，以GST蛋白作為參照，牛血清蛋白（BSA）和磷酸緩沖液分別作為陽性和陰性對照。MDH樣品混合體系如表1。將混合體系進行液氮反復凍融處理（液氮處理1 min后室溫孵育20 min為1個循環）兩次，取每次處理后的樣品10 μL混勻到600 μL對應的反應液中，測定反應起始1 min內A340酶活性變化。每個實驗重復3次。

2 結果

2.1 生物信息學分析

戈壁異常球菌基因組數據分析顯示，Dgo_CA 1605定位于D. gobiensisI-0基因組染色體上，Dgl5（AFD25532）由140個氨基酸組成，分子量為14.5 kD，富含Leu（12.9%）、Ala（11.4%）、Val（12.1%）、Pro（8.6%）等疏水性氨基酸。Kyte-Doolittle親疏水圖（圖1-A）表明該蛋白是一類疏水蛋白。Cspritz顯示該蛋白為有序結構（圖1-B）。氨基酸序列比對（圖1-C）顯示，Dgo_CA1605蛋白含有一個WHy結構域，推測該蛋白屬于LEA5C蛋白家族。利用SMART軟件在線預測Dgl5的結構域，結果顯示，Dgl5含有由123個氨基酸殘基組成的WHy結構域，該結構域含有典型的“NPN”保守位點，與LEA5C蛋白家族WHy結構域類似。綜上所述，Dgl5為疏水蛋白，含有一個典型的WHy結構域，屬于LEA5C蛋白家族。

表1 MDH酶活測定樣品混合體系

圖1 Dgl5序列分析，親疏水性及無序結構預測

為研究Dgl5蛋白與LEA家族蛋白的進化關系，本研究選取了24種LEA蛋白，構建了系統發育樹。黑色箭頭所指為Dgl5蛋白。結果（圖 2-A）顯示，系統發育樹總體分為兩大支。其中一支均為LEA5C家族蛋白，分別來源于植物、古菌和細菌。其中，Dgl5與來源于Deinococcus屬其他細菌的同源蛋白關系最近，與Deinococcus radiodurans中的DrwH蛋白處于同一進化分支。同時通過Blast分析，與Dgl5蛋白同源性較高的蛋白均屬與Deinococcus屬（圖 2-B紅框內），說明Dgl5蛋白是Deinococcus屬特異性蛋白。另一支包含植物LEA1、2、3、4、6和7家族蛋白，該分支蛋白均為親水蛋白?？梢奓EA5C家族蛋白與典型的LEA家族蛋白不同。

2.2 重組大腸桿菌非生物脅迫實驗

已有研究表明LAE5C蛋白與逆境脅迫抗性相關。為了研究Dgl5的功能，本研究對重組E. coli菌株（E. colipET28a-Dgl5/BL21，BL21-1）及僅含空載體pET28a的大腸桿菌（E. colipET28a/BL21，BL21-0）分別進行高鹽、反復凍融及氧化脅迫處理。結果（圖3）顯示，正常條件下表達Dgl5蛋白的重組菌株BL21-1與對照菌株BL21-0生長沒有差異。在培養基中添加500 mmol/L NaCl后，所有菌株的生長速率減慢，與對照菌株BL21-0相比，表達Dgl5蛋白的重組菌株BL21-1的生存能力提高了近一個數量級。對于反復凍融，經反復凍融2次后，生長趨勢與NaCl沖擊結果類似。而在20 mmol/L H2O2沖擊條件下雖然兩個菌株生長狀況下降但兩者并沒有明顯差異。以上結果表明，Dgl5可以提高大腸桿菌抗鹽及抗冷凍的能力，可能參與了高鹽和冷凍脅迫反應。

圖 3 表達Dgl5蛋白重組菌株的表型分析

2.3 Dgl5蛋白的表達純化

本研究表達了帶有GST-tag的Dgl5蛋白用于體外實驗。對GST-Dgl5蛋白進行誘導表達，經親和層析過柱純化，獲得純化后的蛋白。SDS-PAGE分析結果（圖4）顯示，以僅含空載體pGEX4T-2的大腸桿菌及未誘導的表達Dgl5蛋白的重組菌BL21（pGEX4T-2-Dgl5）為空白對照，0.2 mmol/L IPTG誘導下出現與融合蛋白GST-Dgl5大?。?0.5 kD）吻合的條帶。用裂解Buffer洗去雜蛋白，之后用含有10 mmol/L 谷胱甘肽還原酶的洗脫Buffer獲得較高純度的目標融合蛋白GST-Dgl5，收集洗脫液，用Brandford法測定其濃度為0.84 mg/mL，-80℃保存。

圖4 GST-tag的Dgl5蛋白純化

2.4 液氮反復凍融條件下Dgl5蛋白對MDH和LDH活性的保護

結果如圖5（將未脅迫樣品的酶活視為100%），MDH酶活隨反復凍融次數的增加而減少。反復凍融一次后MDH的酶活為80%，反復凍融兩次后損失更嚴重，MDH的酶活僅有50%；而添加Dgl5蛋白后明顯降低了MDH酶活性的損失，MDH活性仍保留90%和70%以上。Dgl5對LDH 在反復凍融下的保護作用與 MDH 結果類似。BSA同樣對MDH和LDH有保護作用，但保護作用低于Dgl5蛋白。另外，GST對MDH和LDH也有保護作用，但是非常微弱。其功能明顯低于Dgl5及BSA蛋白。

圖 5 反復凍融條件下Dgl5對MDH（A）和LDH（B）的保護

3 討論

LEA5C蛋白具有高度疏水性，較低的序列重復性、高比例的非極性氨基酸及熱穩定性較差等特性。本研究通過生物信息學分析發現Dgl5蛋白是一個14.5 kD的小分子蛋白，疏水性氨基酸占總氨基酸的45%，Kyte-Doolittle親疏水圖表明該蛋白屬于疏水性LEA5C蛋白。根據BLAST顯示，Dgl5與Deinococcus屬蛋白親緣關系最近且與同屬蛋白具有較高的序列相似性，是一個Deinococcus屬特異性蛋白。Deinococcus屬微生物可以在極端環境中生存，其擁有非凡的適應機制以抵抗極端環境造成的損傷。Dgl5來自戈壁異常球菌，是分離于戈壁沙漠的Deinococcus屬細菌。為適應沙漠干旱、冷和熱等環境，戈壁異常球菌進化得到了一類能在極端環境下發揮功能的蛋白。關于Dgl5的分析顯示其屬于LEA5C蛋白，一類與脅迫相關的疏水蛋白，可能對戈壁異常球菌適應極端環境有重要作用。

目前為止，有關LEA5C蛋白研究工作集中在序列比較、性質預測、分子鑒定、異源表達等方面，研究表明這些蛋白在干旱、鹽、高低溫、滲透等脅迫條件下大量積累且能提高宿主細胞抵抗非生物脅迫的能力。如Liu等［17］在玉米中鑒定了LEA5C蛋白（ZmLEA5C），編碼該蛋白的基因受低溫、滲透、氧化以及信號分子的誘導，在煙草和酵母中表達，能夠增強細胞耐受滲透和低溫脅迫的能力；Wu和Wang等［18-19］于2014和2016年分別鑒定了來源丹參的LEA5C蛋白（SmLEA和SmLEA2），在大腸桿菌中過量表達能夠顯著提高宿主對干旱和鹽脅迫的抗性。而本研究中，Dgl5在大腸桿菌中異源表達能夠增強大腸桿菌抵抗高鹽和冷凍脅迫的能力。這些結果表明不同細菌來源的LEA5C蛋白有不同的生物學功能，但其本質都與細胞內水分脅迫抗性密切相關，造成功能差異的原因可能是其各自適應極端環境的結果。

LEA5C蛋白與典型的親水LEA家族蛋白不同，是疏水蛋白，進化關系上也明顯處于兩個分支。關于細菌LEA5C基因的由來目前被廣泛認可的說法是“水平轉移”［12］，即細菌通過整合植物防御基因到自己的防御系統中或干擾宿主的信號途徑以應對脅迫環境。大量研究表明，LEA蛋白具有類似分子伴侶的活性，能夠防止脅迫條件下底物蛋白的聚合。Dgl5為LEA5C蛋白，推測其發揮功能的原因是作為分子伴侶保護酶或蛋白免受非生物脅迫的損傷。因此，本研究表達了GST-Dgl5融合蛋白用于體外實驗。體外實驗選用MDH和LDH作為模式酶評估反復凍融條件下GST-Dgl5對底物酶的保護作用。蘋果酸脫氫酶（MDH）是TCA循環途徑的重要酶之一，催化的反應是：蘋果酸+NAD+草酰乙酸+NADH+H+。乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解途徑的關鍵酶，催化的反應是：丙酮酸+NADH+H+乳酸+NAD+。NADH、NAD+分別在340 nm和260 nm波長處有最大吸收峰。因此可以通過檢測A340變化評估MDH與LDH活性。本研究結果顯示Dgl5蛋白在反復凍融條件下可以保護MDH和LDH酶活，說明Dgl5蛋白有類似分子伴侶的功能。但具體的分子機制仍不清晰，根據已有研究報道，具有類似分子伴侶活性的非典型LEA蛋白可以利用其疏水特性使已聚合的蛋白發生解聚［20］。本研究認為Dgl5蛋白有類似的疏水機制穩定底物蛋白，但仍需要大量的實驗證明。

4 結論

本研究確定了戈壁異常球菌（D. gobiensisI-0）中Dgo_CA1605基因編碼的蛋白屬于LEA5C家族蛋白，命名為Dgl5。成功構建了表達Dgl5蛋白的重組菌株E. colipET28a-Dgl5/BL21，非生物脅迫實驗表明該蛋白能增強大腸桿菌抵抗高鹽及冷凍脅迫的能力。表達純化了融合蛋白GST-Dgl5并進行了體外酶活保護實驗。結果表明Dgl5蛋白在反復凍融條件下可以保護MDH和LDH酶活，推測Dgl5蛋白可能具有類似分子伴侶的功能。

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