17β—E2聯(lián)合順鉑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響

鄒路遙　林國(guó)志

[摘要] 目的 研究17β-E2單用或聯(lián)合順鉑（DDP）作用于人卵巢癌細(xì)胞株 HO-8910裸鼠移植瘤的影響。方法 建立人卵巢癌HO-8910裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分成6組：A組（生理鹽水組）、B組（低劑量17β-E2）、C組（高劑量17β-E2）、D組（順鉑5 mg/kg）、E組（低劑量17β-E2+順鉑）、F組（高劑量17β-E2+順鉑），每組5只。觀察各組人卵巢癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況、各組裸鼠的體重改變。 結(jié)果 A組、B組、C組、D組、E組、F組裸鼠體重均增加，B組、C組、D組、E組、F組治療后裸鼠體重均比A組體重輕，但各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B組、C組、D組、E組、F組移植瘤體積、瘤重均明顯減少，其中E組、F組治療后比單獨(dú)用藥體積變化明顯，兩組相比較，F(xiàn)組移植瘤體積、瘤重均更小。 結(jié)論 高劑量17β-E2聯(lián)合順鉑更具有抑制人卵巢癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用。

[關(guān)鍵詞] 17β-E2；順鉑；卵巢癌；移植瘤

[中圖分類號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）04-0039-04

[Abstract] Objective To study the effects of 17β-E2 alone or combined with cisplatin on the growth of transplanted tumor of human ovarian cancer cell line HO-8910 in nude mice. Methods Subcutaneously transplanted tumor model of human ovarian cancer HO-8910 was established and randomly divided into 6 groups： group A（normal saline group）， group B（low dose 17β-E2）， group C（high dose 17β-E2）， group D（cisplatin 5 mg/kg）， group E （low dose 17β-E2+cisplatin）， and group F（high dose 17β-E2+cisplatin）， with 5 mice in each group. The growth of transplanted tumor of human ovarian cancer in nude mice in each group was observed， and the changes of body weight of nude mice in each group were observed. Results The body weight of nude mice in group A， group B， group C， group D， group E and group F was increased， and the body weight of nude mice in group B， C， D， E and F after treatment was all lighter than that in group A， but there was no statistical significance in each group. In group B， group C， group D， group E and group F， the volume of transplanted tumor and the weight of tumor were decreased significantly， and the volume change in group E and group F after treatment was more significant than that of administration alone. Compared between the two groups， the tumor volume and tumor weight in group F were both lower. Conclusion High dose of 17β-E2 combined with cisplatin has a better inhibitory effect on the growth of transplanted tumor of human ovarian cancer in nude mice.

[Key words] 17β-E2； Cisplatin； Ovarian cancer； Transplanted tumor

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，因?yàn)樵缙跓o明顯癥狀，大部分女性查體發(fā)現(xiàn)卵巢癌時(shí)，病情已處于中晚期階段，超過5年生存率的卵巢癌患者僅有40%[1，2]。手術(shù)加術(shù)后輔助化療是主要治療手段。患者術(shù)后卵巢去勢(shì)導(dǎo)致雌激素水平低下而出現(xiàn)絕經(jīng)綜合征，嚴(yán)重影響患者的術(shù)后生命質(zhì)量。激素替代治療（Hormone replacement therapy，HRT）是改善卵巢去勢(shì)婦女雌激素低下癥狀、提高生命質(zhì)量的最佳方法。但上皮性卵巢癌患者術(shù)后應(yīng)用HRT能否促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)尚存在爭(zhēng)議。本文通過建立人卵巢癌HO-8910裸鼠皮下移植瘤模型，觀察不同劑量17β-雌二醇（17β-E2）單獨(dú)或與DDP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的作用，從而為卵巢腫瘤防治研究提供新方法和開創(chuàng)新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910，來自于上海細(xì)胞生物所，是人上皮性腫瘤-卵巢漿液性囊腺癌。SPF級(jí)別裸小鼠BALB/c/nu/nu由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供，均為雌性，4周齡，體重14～15 g，在無菌屏蔽環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)是SCXK（京）20060-0008。

1.2 方法

卵巢癌細(xì)胞株HO-8910，常規(guī)方法復(fù)蘇，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為2×107/mL。每只裸鼠后背部皮下均接種1處，每處0.2 mL，含有4×106個(gè)卵巢癌細(xì)胞。接種1周左右，裸鼠移植瘤長(zhǎng)到約米粒大小時(shí)開始實(shí)驗(yàn)，用剪耳做標(biāo)記法將30只裸鼠隨機(jī)分成6組，每組5只：A組（對(duì)照組，連續(xù)21 d皮下注射生理鹽水，每日劑量為0.2 mL）、B組（每日皮下注射1.3 μg低劑量17β-E2，每次劑量0.2 mL，連續(xù)21 d）、C組（每日皮下注射高劑量17β-E2 3.9 μg，每次注射劑量0.2 mL，連續(xù)21 d）、D組（每日腹腔注射順鉑5 mg/kg，每次0.2 mL，1次/7 d，共4次）、E組（每日皮下注射低劑量17β-E2 1.3 μg，連續(xù)21 d，在低劑量17β-E2治療的第1、7、14、21 d腹腔注射順鉑5 mg/kg，每次均為0.2 mL）、F組（每日皮下注射高劑量17β-E2 3.9 μg，連續(xù)21 d，在高劑量17β-E2 治療的第1、7、14、21 d腹腔注射順鉑5 mg/kg，每次均為0.2 mL）。每只裸鼠接種一點(diǎn)，觀察裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況。

1.3觀察指標(biāo)

監(jiān)測(cè)移植瘤接種成活率，給藥期間每4日用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)（a）、寬（b），按體積（V）=πab2/6計(jì)算瘤體積，繪制移植瘤的生長(zhǎng)曲線，每4天稱取裸鼠體重1次。末次給藥24 h后，采用脫臼法處死裸鼠。完整剝出瘤組織，并測(cè)量移植瘤重量。同時(shí)觀察瘤塊情況及有無周圍組織浸潤(rùn)。并計(jì)算裸鼠移植瘤的抑瘤率。

公式=×100%。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)分析和統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析、雙因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠一般情況及體重改變

卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠身上后，接種的裸鼠移植瘤成活率均為100%，所有裸鼠的后背部皮下均長(zhǎng)出瘤體。早期移植瘤表面光滑，為圓形或橢圓形的實(shí)體瘤，后期逐漸形狀不規(guī)則，表面凹凸不平，可見很多的血管網(wǎng)交替連接，多個(gè)結(jié)節(jié)融合一起。個(gè)別瘤體表面有出血壞死。各組裸鼠一般情況均較好，飲水進(jìn)食正常，反應(yīng)靈活，活動(dòng)正常，體重增加。用藥前后各組裸鼠的體重?zé)o明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。治療后兩兩比較，用藥組裸鼠體重均比A組體重輕，各組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組裸鼠腫瘤體積變化

治療過程中，A組移植瘤生長(zhǎng)迅速，其體積一直大于其他各組的體積，可以認(rèn)為不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量體積的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療結(jié)束后，各組腫瘤體積與A組腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D、E、F組與A、B、C組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D組、E組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組、F組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。F組體積明顯小于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000<0.05）。見表2。

2.3 不同藥物對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制效果

各治療組瘤重均比A組輕，結(jié)果表明各治療組移植瘤的瘤重均輕于A組。而且E組、F組的瘤重比D組輕。A組抑瘤率為0.00，B組抑瘤率為40.91%，C組抑瘤率為43.99%，D組抑瘤率為50.84%，E組抑瘤率為55.94%，F(xiàn)組抑瘤率為67.70%。見表3。

3討論

卵巢癌是女性生殖器官疾病中比較常見的腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率位居第3位。但因卵巢癌致死者卻占首位，嚴(yán)重威脅婦女的生命。手術(shù)難以治愈，一般需要化療來延續(xù)治療。聯(lián)合化療一般以鉑類為主，在多數(shù)卵巢癌中起明顯作用，但因長(zhǎng)期的副作用，如骨髓抑制、患者耐藥、停藥后復(fù)發(fā)等，使很多患者無法接受。激素替代療法可以人為地補(bǔ)充外源性雌激素，體內(nèi)激素水平得以改善，許多卵巢癌手術(shù)后的更年期綜合征癥狀得以改善。正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤及卵巢惡性腫瘤組織中均有雌激素受體存在[3]。17β-雌二醇可于胎盤、卵巢等中提取。17β-雌二醇也用于生物試驗(yàn)，其干擾未成熟的或已經(jīng)切除卵巢的大鼠陰道分泌物，顯微鏡下陰道分泌物呈現(xiàn)由角化細(xì)胞組成。國(guó)外學(xué)者[4]在試驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)ERβ，提出原來的ER定義為ERα，其在卵巢惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，而ERβ主要在良性腫瘤及人的正常上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。在上皮性卵巢癌中較正常卵巢，ERα呈上升趨勢(shì)，ERβ呈下降趨勢(shì)[5]，在漿液性和黏液性卵巢癌中ER呈現(xiàn)高表達(dá)，所以，卵巢癌患者接受激素替代輔助治療是否有效果，以及在激素替代治療作用下機(jī)體內(nèi)是否發(fā)生一些生物化學(xué)反應(yīng)等一系列問題尚需研究。

為探討卵巢癌患者術(shù)后應(yīng)用激素替代是否復(fù)發(fā)及對(duì)患者生存的影響，有文獻(xiàn)[6]隨機(jī)在373例患者中選取78例患者采用激素替代治療，結(jié)論是在卵巢癌的復(fù)發(fā)率及生活質(zhì)量等方面，應(yīng)用激素替代與未應(yīng)用激素替代者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)雜志于2002年刊出的基礎(chǔ)干預(yù)研究中，其結(jié)論關(guān)于使用激素治療有很大的影響力[7]。研究報(bào)道中婦女絕經(jīng)后使用雌激素/孕激素，兩者應(yīng)用使血脂譜發(fā)生明顯變化[8]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用雌激素后婦女骨折的風(fēng)險(xiǎn)減少，而深靜脈血栓、腦血栓患病率增加，此結(jié)論與雌孕聯(lián)合應(yīng)用組一致。與對(duì)照組相比，在直腸癌、冠心病、結(jié)腸癌、乳腺癌中單獨(dú)使用雌激素，雌激素的危險(xiǎn)方面沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]。相關(guān)文獻(xiàn)[10]選擇絕經(jīng)前后134例卵巢癌患者，在手術(shù)后8周分為兩組，進(jìn)行前瞻性隨機(jī)對(duì)照分析研究，其目的是研究雌激素是否影響卵巢癌的復(fù)發(fā)，以及對(duì)患者的生存質(zhì)量是否有影響。卵巢癌患者一組接受安慰劑治療，另一組接受結(jié)合性雌激素治療，每日0.625 mg，結(jié)果表明62例激素替代患者中統(tǒng)計(jì)出59例，其中卵巢癌復(fù)發(fā)32例（54%）。卵巢癌復(fù)發(fā)后總生存期為35個(gè)月，不影響生活質(zhì)量的生存時(shí)間2年左右。總生存期與不影響生活質(zhì)量的生存時(shí)間無明顯差異。結(jié)論表明激素替代治療不會(huì)干擾患者的生存質(zhì)量。

17β-E2主要是由卵巢分泌產(chǎn)生的一種性激素，維持外陰、陰道、子宮、輸卵管的生理作用，促進(jìn)這些器官的生長(zhǎng)和發(fā)育成熟。在臨床中，雌激素作為藥物，可用于預(yù)防骨質(zhì)疏松、冠心病、老年癡呆癥等老年病，主要用于治療圍絕經(jīng)期及更年期綜合征。人們已經(jīng)關(guān)注到17β-E2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、導(dǎo)致腫瘤形成等潛在的副作用。在1998年進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究，其結(jié)果是：患者應(yīng)用雌激素10年以上者，發(fā)生卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)增加1/4。然而6項(xiàng)研究中，激素替代治療10年者僅有1項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌發(fā)生危險(xiǎn)明顯增加。總之，卵巢癌發(fā)生危險(xiǎn)增加1/4，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，因此可以認(rèn)為卵巢癌的發(fā)生與雌激素應(yīng)用無關(guān)。關(guān)于雌激素在人體內(nèi)的影響一直存在爭(zhēng)論。一些人認(rèn)為雌激素在晚期前列腺癌、乳腺癌中應(yīng)用有效[11]。故有必要在此方面加強(qiáng)研究，有效利用雌激素的作用，在臨床治療中得以應(yīng)用，減少和避免不良的副反應(yīng)發(fā)生。有研究[12，13]對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究17β-E2對(duì)其是否有增殖或抑制作用，結(jié)論是生理濃度下17β-E2降低細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡。但是目前關(guān)于17β-E2對(duì)人卵巢癌的試驗(yàn)研究相對(duì)較少。

此實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建裸鼠移植瘤模型是關(guān)鍵。裸鼠移植瘤模型的影響因素，包括以下幾點(diǎn)：（1）裸鼠：SPF級(jí)別，無菌環(huán)境下生長(zhǎng)，熟悉裸鼠的生活習(xí)性，食物、水等均要達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。（2）卵巢癌細(xì)胞數(shù)量：形成裸鼠移植瘤，細(xì)胞數(shù)量至少為1×106個(gè)，最好細(xì)胞數(shù)量達(dá)到5×106個(gè)，成瘤率才高。瘤細(xì)胞量過低，不易于成瘤，少于1×105個(gè)僅使個(gè)別裸鼠成瘤[14]。因此在本實(shí)驗(yàn)中，接種正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞，接種在裸鼠后背部皮下，每只0.2 mL，接種的卵巢癌細(xì)胞數(shù)量為4×107個(gè)細(xì)胞，接種后可見裸鼠后背部均有結(jié)節(jié)狀突起，裸鼠移植瘤成瘤率100%，伴隨著實(shí)驗(yàn)研究，瘤組織逐漸增大。（3）17β-E2用量：依據(jù)人和動(dòng)物等效劑量換算法[15]，人每天用量×2.6×10-3=裸鼠每天用量，以及17β-E2臨床用藥劑量為1.5 mg/d、0.5 mg/d。因而計(jì)算出治療組中每只裸鼠接種17β-E2劑量為0.0039 mg/d、0.0013 mg/d。A組中每天給予注射生理鹽水0.2 mL。晚上裸鼠的雌激素水平最高，因此每天19點(diǎn)按時(shí)在裸鼠身上注射藥物。

本實(shí)驗(yàn)通過成功構(gòu)建卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，于裸鼠移植瘤上注射不同藥物，比較治療前后裸鼠的體重、移植瘤的瘤體積、瘤重及抑瘤率。試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)各組裸鼠體重均有增加，各用藥組治療后裸鼠體重均比A組體重輕，但各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各治療組移植瘤體積均減小，各治療組間瘤重均有明顯減少，其中低劑量17β-E2+DDP、高劑量17β-E2+DDP治療后比單獨(dú)用藥體積變化明顯，兩組相比較，高劑量17β-E2+DDP移植瘤體積、瘤重均更小。因此得出結(jié)論，各治療組與A組相比，均有抑制卵巢癌移植瘤生長(zhǎng)的作用，而且高劑量17β-E2抑瘤效果更明顯。17β-E2聯(lián)合順鉑抑瘤效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，其中高劑量17β-E2 聯(lián)合DDP抑瘤作用最明顯。本研究結(jié)果表明不同劑量17β-E2單用能抑制移植瘤生長(zhǎng)，高劑量17β-E2聯(lián)合順鉑更能有效抑制移植瘤的生長(zhǎng)。因此，17β-E2聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌的臨床治療有指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2017-02-20）