二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠牙周組織的影響

黃輝　黃炫賡　于大海

[摘要] 目的 研究實驗性糖尿病牙周炎大鼠牙周組織的變化，探討二甲雙胍對其影響。 方法 將240只雄性大鼠隨機分成實驗組（二甲雙胍治療）、糖尿病牙周炎組、牙周炎組和空白對照組，每組各60只大鼠。動物模型建立后3周、6周和9周分批處死10只大鼠取樣，測量實驗牙近中牙槽嵴頂至釉牙骨質界的距離（CEJ-A），比較各組光密度值。 結果 在術后3周、6周和9周3個時間點，實驗組大鼠的CEJ-A和光密度值高于空白對照組而低于糖尿病牙周炎組和單純牙周炎組；而且隨著時間的推移，糖尿病牙周炎組和單純牙周炎組的CEJ-A值逐漸升高，實驗組CEJ-A值逐漸下降，空白對照組則沒有明顯變化；除實驗組光密度值逐漸下降，其他三組則沒有明顯變化。 結論 二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠的牙周組織具有保護作用。

[關鍵詞] 二甲雙胍；大鼠；糖尿??；牙周炎

[中圖分類號] R781.4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）04-0043-04

[Abstract] Objective To investigate the changes in periodontium in rats with experimental diabetic periodontitis and estimate the influence of metformin on the periodontium. Methods 240 male rats were divided randomly to experimental group（metformin treatment）， diabetic periodontitis group， periodontitis group and control group， with 60 rats in each group. Every 10 rats were sacrificed at the time point of 3 weeks， 6 weeks and 9 weeks after the establishment of the model. The distance from alveolar crest to cemento-enamel junction（CEJ-A） was measured， and the optical density value amorg groups was compared. Results At postoperative 3w， 6w and 9w time points， the CEJ-A distance and optical density in the experimental group was higher than that of the control group， while less than that of the diabetic periodontitis group and periodontitis group. CEJ-A value in the diabetic periodontitis group and periodontitis group gradually increased over time， meanwhile， the value of the experimental group descended eventually， and that of the control group remained no noticeable changes. By contrast， optical density of experimental group gradually descended， while that of the other groups remained no changes. Conclusion Metformin has protective effect on periodontium of rats with experimental diabetic periodontitis.

[Key words] Metformin； Rat； Diabetes； Periodontitis

牙周炎在糖尿病人群中發病率較高，糖尿病人群中合并牙周炎者可高達85%～90%[1]。糖尿病可增加牙周炎的發病風險和加重牙周組織破壞程度，牙周炎與糖尿病相互影響，互為高危因素，牙周炎已被認為是糖尿病的第六大并發癥[2]。作為治療2 型糖尿病的一線用藥，二甲雙胍亦具有一定的抗炎[3]、抗氧化作用[4]。本研究探討二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠牙周組織的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

從廣西醫科大學動物中心分批采購同種系的清潔級Wistar雄性大鼠240只，200 g左右/只。由電腦生成隨機數字，并由此隨機分成實驗組（糖尿病牙周炎大鼠+二甲雙胍治療）、糖尿病牙周炎組、單純牙周炎組和空白對照組，每組各60只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體（CST公司，批號：9662S），免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K175622F），圖像分析軟件（美國BIO-RAD Laboratories公司），顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2.2 糖尿病模型建立 大鼠適應性喂養3 d，給予足量的飼料，自由飲水。禁食12 h，鏈脲佐菌素（STZ）使用前用0.1 mol/L pH4.5的枸櫞酸緩沖液配制成2%濃度，按照60 mg/kg的劑量，一次性腹腔注射。3 d后取鼠尾靜脈血檢測血糖，血糖濃度≥19 mmol/L納入實驗組；<19 mmol/L則繼續腹腔注射STZ（30 mg/kg），3 d后再測血糖，血糖濃度≥19 mmol/L繼續納入實驗組，<19 mmol/L排除。

1.2.3 牙周炎模型建立 實驗組、糖尿病牙周炎組大鼠在糖尿病模型建立3 d后，以及單純牙周炎組大鼠在喂養3 d后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用直徑0.2 mm正畸結扎絲加絲線結扎大鼠右上頜第一磨牙牙頸部?？瞻讓φ战M大鼠適應性喂養3 d后，注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。3 d后10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，不作干預待其自然蘇醒。

1.2.4 模型建立后的喂養 實驗組、糖尿病牙周炎組、單純牙周炎組及空白對照組繼續普通飼料喂養。實驗組大鼠給予二甲雙胍100 mg/（kg·d）灌胃，其他組給予同體積蒸餾水灌胃。

1.3檢測指標

1.3.1 標本采集 在結扎后3周、6周和9周，每組每批處死10只大鼠，斷頭法處死大鼠，迅速分離大鼠上頜骨，在上頜中線處將其一分為二。通過大體照片及X線片觀察右上頜第一磨牙牙槽骨吸收情況，截取的組織塊脫鈣、梯度脫水、石蠟包埋、切片，用于HE染色和細胞凋亡蛋白檢測。

1.3.2 骨吸收測量 將石蠟切片用蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，德國DMR+Q550病理圖像分析儀測量釉牙骨質界（CEJ）至第一磨牙近中牙槽嵴頂（A）的垂直距離（CEJ-A），以評價各組大鼠右上頜第一磨牙牙槽骨的吸收情況，均取5張切片的平均值。

1.3.3 光密度值檢測 按說明進行操作。結果判斷：Caspase-3陽性染色為細胞質和（或）細胞內棕黃色顆粒著色。將切片在高倍鏡下（×400）觀察，并隨機選取3個有陽性細胞密集面且不重疊的視野，計算陽性細胞的平均光密度，以光密度值表示Caspase-3蛋白表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS17.0統計學軟件分析數據，計量資料采用重復測量方差分析，按α=0.05水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CEJ-A和光密度值術后變化

所有實施步驟均由同一人完成。最終完成120只大鼠標本的采集，各組各指標數據見表1。

2.2 CEJ-A重復測量數據方差分析結果

見表2。CEJ-A的時間因素（F時間=93.860，P<0.001）以及時間和分組的交互作用（F時間×分組=82.579，P<0.001）有統計學意義，提示CEJ-A有隨時間變化的趨勢并且時間因素的作用隨著分組的不同而不同。結合表3和圖1可直觀地看到，CEJ-A在不同組別、不同時間點方面有差異（F分組=1667.183，P<0.001）。在術后3周、6周和9周3個時間點，CEJ-A值最高為糖尿病牙周炎組，其次為單純牙周炎組，再次實驗組，空白對照組則最低；而且隨著時間的推移，糖尿病牙周炎和單純牙周炎組的CEJ-A值逐漸升高，實驗組逐漸下降，空白對照組則沒有明顯變化。

2.3 光密度重復測量數據方差分析結果

如表2、表3所示，光密度的時間因素（F時間=197.396，P<0.001）、時間和分組的交互作用（F時間×分組=203.896，P<0.001）以及分組因素（F分組=125.735，P<0.001）差異有統計學意義，提示光密度有隨時間變化的趨勢，在不同組別、不同時間點有差異。結合圖2可直觀地看到，在術后3周、6周和9周3個時間點，光密度值最高是糖尿病牙周炎組，其次是單純牙周炎組，再次實驗組，空白對照組則最低；而且隨著時間的推移，除實驗組的光密度值逐漸下降，其他三組則沒有明顯變化。

3討論

牙周炎是在病原體及其產物作用下，局部組織內免疫細胞大量浸潤釋放炎癥介質，進一步激活巨噬細胞等免疫細胞釋放細胞因子，大量炎性介質介導免疫細胞黏附聚集到炎癥部位，從而造成局部組織破壞[5]。而糖尿病可引起持續更久的炎癥反應，更多的附著喪失，更嚴重的牙槽骨吸收，使骨修復能力明顯受損，妨礙新骨形成[6]。已有研究表明，糖尿病牙周炎大鼠牙周組織中骨襯細胞、成骨細胞和牙周膜成纖維細胞的凋亡增加，成骨細胞數目降低，骨形成減少[7]。在本次研究中我們也發現，在術后3周、6周和9周3個時間點，CEJ-A值最高是糖尿病牙周炎組，其次是單純牙周炎組，再次實驗組，空白對照組則最低；而且隨著時間的推移，糖尿病牙周炎和單純牙周炎組的CEJ-A值逐漸升高，實驗組逐漸下降，空白對照組則沒有明顯變化。這說明糖尿病牙周炎大鼠牙周組織破壞最嚴重，其次是單純牙周炎者，破壞較少的是使用二甲雙胍喂養的大鼠牙周組織，提示二甲雙胍對糖尿病牙周炎大鼠牙周組織具有保護作用。

細胞凋亡是細胞死亡的另一種形式，其機制是細胞內特定的信號分子啟動，且由基因調控的自我消亡過程。炎癥細胞的凋亡參與牙周炎的發生、發展過程[8]，而細胞凋亡在牙周炎牙槽骨吸收中起著重要作用[9]。Mashat等[10]研究曾表明糖尿病可增加Caspase-3的活性，并證實糖尿病牙周炎牙周組織喪失的重要機制是成纖維細胞和成骨細胞凋亡的增強。二甲雙胍（Metformin）是 2型糖尿病治療的一線用藥，目前研究指出二甲雙胍可以抑制細胞凋亡的發生[11，12]。為進一步探討二甲雙胍對骨組織的保護作用機制，我們也對大鼠牙周組織Caspase-3的表達進行檢測。Caspase-3是Caspase家族在凋亡級聯反應中最為關鍵的凋亡蛋白酶。Caspase-3激活后，可降解DNA損傷修復酶，同時激活核酸內切酶，促進細胞凋亡[13]。在研究中發現，光密度值表達最高的是糖尿病牙周炎組，其次是單純牙周炎組，再次實驗組，空白對照組則最低；而且隨著時間的推移，除實驗組的光密度值表達逐漸下降，其他三組沒有明顯變化。光密度值表達變化與CEJ-A的變化趨勢是一致的，提示光密度值表達代表了細胞凋亡的變化，具體到牙周組織中就是CEJ-A的變化，也間接反映骨破壞的減少。而喂養二甲雙胍的大鼠則有抗凋亡的表現，表現為光密度值活性下降，與王小芳等[14]的研究結果相似，其在原代心肌細胞的凋亡實驗中也證實了二甲雙胍可明顯抑制Caspase-3的表達。其機制可能在于二甲雙胍通過激活AMPK，抑制NF-κb的激活及活性氧族的生成，減少Caspase-3的表達[15]。

綜上所述，二甲雙胍可抑制凋亡蛋白的表達，減少成骨細胞的凋亡，減少骨破壞增加。因此，二甲雙胍對實驗性糖尿病牙周炎大鼠的牙周組織具有保護作用。

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（收稿日期：2017-11-15）