微小RAN與肝相關疾病診療的關系

方安寧，嚴家來，周衛鳳，黃玲，丁艷

（1.安徽醫學高等專科學校，安徽合肥230601；2.南京市第二醫院，江蘇南京210003）

1　miRNAs的產生及其在肝組織中的表達

成熟的miRNAs是一類長約21～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，編碼miRNAs的基因在細胞核中經RNA聚合酶Ⅱ加工生成一種長度約為70 nt的初始轉錄本pri-miRNAs。該轉錄本在RNA酶Dorsha的作用下加工成miRNA前體pre-miRNA。Exportin 5蛋白能與pre-miRNA特異性結合并將其輸出細胞核進入細胞質。進入細胞質的pre-miRNA在Dicer酶的作用下進一步被剪切成為一個不穩定的dsRNA分子，接著在解旋酶的作用下生成成熟的單鏈miRNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯區（UTR）和編碼區域的堿基互補配對抑制靶mRNA翻譯，在轉錄水平調控靶基因表達[2]。miRNAs的功能非常重要，包括參與早期發育、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡、脂肪代謝和細胞分化，目前認為體內至少30%的基因表達受miRNAs調控[3]。

既往對miRNAs的研究主要集中于它們在細胞內的活動，目前已有一些文獻報道了在肝癌中表達失調的miRNAs[4-15]，隨著miRNAs功能研究的不斷深入，miRNAs在肝癌發生發展過程中的作用也逐漸被研究者所關注。自2005年Murakami等首次報道miRNAs在正常肝臟和肝癌中的表達差異以來，已有多篇文獻報道了肝癌中異常表達的miRNAs[4-15]。在肝癌中表達上調的miRNAs有：miR-122、miR-21、miR-199a/b-3p、miR-223等，在正常肝臟中僅有9個miRNAs處于高豐度表達，占整個肝臟的miRNAs組的88.2%。其中表達最高的是miRNAs-122，第三高的miRNAs199a/b-3p的低表達與生存期顯著相關。在HCC中表達下調的miRNAs有Let-7a、miR-101、miR-122、miR-125a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26和miR-29等。由HsuPW[16]預測人類miRNAs在病毒基因中作用位點的一個軟件（http：vita.mbe.nctu.edu.tw），Let-7a是HBV基因組的保守序列中的一個潛在的作用位點。另有文獻[17-18]報道組織中miR-17-5p在肝癌轉移中升高，可以作為預后標志物。miRNAs在肝相關疾病組織中的研究比較熱門，但無法確定哪一個或哪幾個miRNA的表達失調在HCC發展中發揮核心作用，但是我們還是可以看出一些在肝癌診斷方面達成共識的miRNAs，像miR-122a、miR199[19]等，在肝癌中不同miRNAs的表達所影響的信號通路（見圖1）[4]可以很直觀地發現受體絡氨酸激酶（這里表示肝細胞生長因子HGF/蛋氨酸原癌基因MET唯一軸），RAS和P13K途徑被下調的miR-199a/b-3p，Let-7和上調的miR-21所影響，導致細胞的癌變。miR-199a/b-3p、Let-7、miR-21這3種miRNA在病毒肝炎、肝硬化及肝細胞性癌患者的外周循環中也比較有意義，是否可以作為腫瘤標志物尚不可知。在HCC腫瘤發生過程中各種miRNAs所起的作用，其中miR-21、miR-199、miR-221、miR-122、miR-101和Let-7同樣起重要作用，見圖2[12]。

圖1　肝癌中不同miRNAs的表達的信號通路示意圖

圖2　miR－21、miR－199、miR－221、miR－122、miR－101和Let－7在HCC發生中的作用

2　血清循環miRNA與疾病的診斷

半個多世紀前，Mandel和Metais在血漿和血清中發現了循環核酸（CNAs）[20]。隨著不斷改進檢測技術和方法，循環核酸在臨床疾病診斷中的應用得到了較大進步，在很多領域取得了巨大成就，如器官移植、遺傳性疾病的產前檢查等[21]。早期的研究也表明，在腫瘤患者的血漿中，RNA的量顯著增加，腫瘤細胞的基因表達譜也和正常細胞有顯著差異[22-23]。近年來發現的miRNA也和腫瘤等各種疾病的發生發展有著密切的聯系。由于病變組織細胞中的miRNA表達往往失調，且miRNA在血漿中極其穩定，研究者推測miRNA可以作為一種理想的以血液檢測為基礎的生物標志。

Chen等[24]通過對健康中國人的血清進行Solexa測序，鑒定了男性和女性血清中的miRNA數目分別為100和91。Taylor等[25]對同一卵巢癌患者的細胞和外核體研究發現，在467條miRNA中有218條呈現陽性。Mitchell等[26]通過分離健康人血漿中的18～24個核苷酸的RNA，得到37種左右miRNAs，包括Let-7a、miR-16、miR-15b等。對3份獨立的健康人血漿miR-16、miR-24（血漿中中等豐度表達）和miR-15b（血漿中低等豐度表達）進行qRT-PCR分析，發現這3種miRNAs的濃度為8 910～133 970拷貝/微升。同時，他們將人的前列腺癌細胞22Rvl導入NOD/SCID免疫缺陷小鼠中，發現能在小鼠血漿中檢測到原本不存在的miR-629*和miR-660，而且miRNAs的豐度與腫瘤的大小相關，并可作為診斷腫瘤的生物標志物。

3　循環中miRNAs與肝相關疾病診療的關系

循環中miRNAs可作為疾病的“指紋”去預測生存狀態[27-30]。大多數人認為循環RNA來自細胞凋亡或壞死、細胞主動釋放以及循環細胞的分裂。有些核酸蛋白1（NPM1）能夠介導部分miRNAs由胞內釋放到胞外并且保護它在胞外不被核酸酶降解，有些循環miRNA由多種未知的成分構成。由于它們含量豐富且具有組織的特異性、循環中的相對穩定性，循環中miRNAs作為獨特的、易獲得的分子標志物來檢測和監控癌癥具有深遠的影響。循環中的miRNAs能夠反映組織的一些信號，像丙型肝炎患者血清miR-122表達比正常人高，且和ALT表達有非常高的一致性[31]，而且還與病毒載量、乙肝表面抗原量、γ谷氨酰轉移酶（GGT）等相關[32]。有學者報道miR-500在外周血中的表達隨肝癌術前術后發生變化，但只觀察了3例[33]。最新研究表明，miR-101可能是HBV相關肝癌診斷及進展監控的潛在標志物[34-35]。

循環miRNAs在肝癌中表達失調的報道比較少[36]，具體哪些miRNA在診斷中起主要作用目前還存在很多爭論，距離在臨床診斷中應用還有待進一步驗證。本課題擬進行如下3個方面工作：（1）以乙型及丙型肝炎單獨和重疊感染、肝硬化和肝細胞癌患者血清為參考樣本，通過exqion的LNATMmiRNA芯片對健康對照、肝硬化及肝癌患者血清中潛在的循環miRNAs進行初步分析與對比，篩選可能與肝病相關的miRNAs；（2）通過臨床病例對照研究，用莖環法實時熒光定量PCR對幾種可能與肝病相關的循環miRNAs進行初步驗證，以此初步探索循環miRNAs作為肝臟相關疾病分子標志物的可能性，再聯合AFP、AFP-L3及GP73做相關性研究及通過受試者工作特征曲線（ROC曲線）來評價實驗的特異性和準確性；（3）利用生物信息學并結合有關文獻，對優勢的miRNAs潛在靶基因進行預測并探討肝病患者血清中的miRNAs可能原因。期待能發現特異性較強的miRNAs生物標志物，為早期診斷或鑒別診斷肝癌及為肝相關疾病的miRNAs靶向治療提供依據。

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