玉米蛋白水解物對奶牛瘤胃體外發酵及纖維素酶活的影響

姜　鑫，　劉　帥，　徐宏建，　張永根

（東北農業大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱 150030）

玉米蛋白粉是工業上利用玉米生產淀粉后產生的主要副產物之一，其蛋白質含量較高，約占干物質的60%～75%，還含有脂肪和纖維素等成分。玉米蛋白粉的代謝能高于玉米，氨基酸總量高于豆粕和魚粉，目前作為蛋白補充，被廣泛應用于飼料生產中。然而由于玉米蛋白粉中主要含有醇溶蛋白和谷蛋白，醇溶蛋白分子中存在大區域的α-螺旋結構，具有很強的疏水性，谷蛋白只溶于堿水溶液，二者的水溶性差，且氨基酸不平衡，導致玉米蛋白粉在反芻動物體內不易被消化吸收，對瘤胃微生物發酵和群體結構的影響明顯低于魚粉和豆粕（王夢芝，2009）。利用微生物發酵玉米蛋白粉，可以將其中的玉米蛋白水解為小的短肽分子，這類短肽分子具有多種功能，如抗氧化 （Luo等，2014）、免疫等功能。研究表明，玉米蛋白水解物（CPH）可以促進瘤胃微生物生長，改善瘤胃壞境（程茂基等，2004）。據報道，CPH可以提高豁眼鵝的生長性能（童輝等，2009），減弱生雞肉靡脂質氧化（許瑞雪等，2016）。國外也有報道，CPH對大鼠肝組織損傷具有一定的治療作用 （Luo等，2014），并且還可以提高蛋雞的生產性能（Gunawardana等，2009）。目前關于CPH在奶牛生產中應用的研究鮮有報道，因此，本試驗研究了在全混合日糧（TMR）中添加CPH對奶牛瘤胃體外發酵及纖維素酶活的影響，以期為CPH能夠應用于奶牛生產中提供理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1CPH制備利用微生物發酵法制備CPH。具體方法如下：玉米蛋白粉與麩皮以8∶2的比例混合作為培養基，料水比（m/V）＝1∶2，以納豆芽孢桿菌：脈孢霉為7∶3的比例接種，接種量為0.31%（m/m），接種順序為先接種脈孢霉，12 h后再接種納豆芽孢桿菌，32℃培養40 h后取5 g發酵后的玉米蛋白粉于50 mL離心管中，添加一定比例的去離子水（1∶9，m/V），漩渦振蕩器振蕩 2min，40 ℃條件下恒溫振蕩1 h，20000 g離心，離心后用0.22μm濾膜過濾，真空冷凍干燥濾液得CPH，-20℃保存備用。

1.1.2TMR體外發酵底物為TMR，基礎日糧組成及營養水平見表1（干物質基礎）。

1.2供體動物及瘤胃液的采集3頭安裝永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛，體重（600±25）kg，每日飼喂兩次（07:00和18:00），自由飲水。奶牛飼喂日糧營養水平與發酵底物相同（表1）。晨飼前1 h分別采集3頭奶牛的瘤胃液，均勻混合，瘤胃液通過四層紗布進行過濾。

表1　基礎日糧組成及營養水平

1.3試驗設計本試驗采用單因素完全隨機試驗設計，設Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個處理組，分別添加0、0.06、0.12 g/L 和 0.24 g/L CPH， 每個處理設 3個重復，進行奶牛瘤胃體外發酵試驗。

1.4體外發酵分別稱取 13.2 g CaCl2·2H2O、10.0 g MnCl2·4H2O、1.0 g CoCl2·6H2O、8.0 g FeCl3·6H2O、4.0 gNH4HCO3、35.0 gNaHCO3、5.7 gNa2HPO4、6.2 g K2HPO4、0.6 g MgSO4·H2O、0.1%刃天青及 4mg NaOH，加入蒸餾水定容至l000 mL，制成緩沖液（pH 6.9），通入CO2至過飽和。并按瘤胃液∶緩沖液以1∶2的比例混勻，配置人工瘤胃液。準確稱取0.2 g底物加入到纖維袋內，并置入100mL注射器內，加入30 mL體外發酵液，置于恒溫水浴搖床中，39℃下恒溫培養。

1.5樣品采集和指標測定采集體外發酵24 h內發酵液，經四層紗布過濾，用于測定pH、菌體蛋白和纖維素酶濃度，部分按與發酵液相應比例添加25%的偏磷酸，用于測定瘤胃液VFA和NH3-N的濃度。所有樣品放于-20℃冰箱保存。

1.5.1發酵液pH、NH3-N和VFA濃度測定采用 pH（Startorius，PB-10）測定體外發酵 24 h 內發酵液pH；采用馮宗慈比色法測定瘤胃液NH3-N濃度；采用氣相色譜儀（島津GC-2010，日本）測定瘤胃液中VFA濃度。

1.5.2發酵液菌體蛋白濃度測定采用嘌呤法（劉晶等，2014）測定發酵液中菌體蛋白濃度。

1.5.3發酵液纖維素酶活性和干物質消失率測定纖維素酶活性的測定參照 《反芻動物營養學研究方法》中的方法 （王加啟，2011）。酶活單位（IU）指每分鐘每毫升酶液作用于底物生成的還原糖量（μmol）。

采集體外發酵24 h內發酵液后，取出纖維袋，蒸餾水沖洗3次后，在105℃下烘干4 h，干燥器中冷卻后稱重，計算體外干物質消失率。

1.6數據統計分析

產氣量計算公式為：GP＝a＋b（1-exp-c×t）；

式中：a為可溶性快速產氣量，mL/0.1 g底物；b為不可溶性慢速產氣量，mL/0.1 g底物；c為產氣速率GP/h。

利用SAS 9.2的非線性（NLIN）方程對氣體產率進行分析。有效產氣速率（EGp）計算公式為：

式中：c為產氣速率常數；k為一段速率常數，假定為 0.05/h（Wang 等，2012）。

其他數據采用SAS 9.2軟件包中的mixed模型，根據正交多項式系數表選擇3階系數對數據進行趨勢性分析，P＜0.05表示差異顯著，結果用“平均值±標準誤”的形式表示。

2　結果

2.1CPH對體外發酵24 h產氣量的影響CPH對體外發酵24 h產氣量的影響見表2和圖1。隨發酵時間延長，各組發酵液產氣量呈上升趨勢。24 h試驗組產氣量、慢速產氣部分、潛在產氣部分和有效產氣速率均顯著高于對照組（P＜0.05），其中試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ產氣量分別較對照組升高5.32%、7.45%和10.64%。且隨添加量的增加，各組產氣量呈線性增加。

表2　CPH對體外發酵24 h產氣量的影響

圖1　添加不同水平CPH體外發酵24 h內產氣量的動態變化

2.2CPH對體外發酵24 h pH、NH3-N和VFA濃度的影響CPH對瘤胃pH、NH3-N和VFA濃度的影響見表3和圖2～7。隨發酵時間延長，各組發酵液pH呈下降趨勢。24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發酵液pH分別較對照組降低0.60%、0.75%和1.35%（P＜0.05），且隨添加量的增加，各組發酵液pH呈線性下降。

隨發酵時間延長，各組發酵液NH3-N濃度呈現上升趨勢。24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發酵液NH3-N濃度分別較對照組升高3.05%、4.67%和11.42%（P＜0.01），且隨添加量增加，各組NH3-N濃度呈線性增加。

表3　CPH對體外發酵24 h pH、NH3-N和VFA濃度的影響

圖2　添加不同水平CPH體外發酵24 h內pH的動態變化

圖3　添加不同水平CPH體外發酵24 h內NH3-N濃度的動態變化

圖4　添加不同水平CPH體外發酵24 h內乙酸濃度的動態變化

圖5　添加不同水平CPH體外發酵24 h內丙酸濃度的動態變化

圖6　添加不同水平CPH體外發酵24 h內丁酸濃度的動態變化

圖7　添加不同水平CPH體外發酵24 h內總揮發酸濃度的動態變化

隨著發酵時間延長，各組發酵液總揮發酸、乙酸、丙酸和丁酸濃度呈現上升趨勢。24 h試驗組發酵液總揮發酸、乙酸、丙酸和丁酸濃度均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別較對照組升高16.81%、19.97%和23.57%，并隨添加量的增加呈線性升高，且具有一定的二次和三次效應，試驗組Ⅲ和Ⅳ乙比丙值較對照組分別降低10.00%和7.92%（P＜0.01）。

2.3CPH對體外發酵24 h纖維素酶活、菌體蛋白和體外干物質消失率的影響CPH對體外發酵24 h纖維素酶活性、菌體蛋白濃度和體外干物質消失率的影響見表4。24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發酵液內水楊甘酶含量分別較對照組升高1.24%、6.19%和8.05%（P＜0.01），且各組發酵液內水楊甘酶含量隨CPH添加量增加呈線性升高。

表4　CPH對體外發酵24 h纖維素酶活、菌體蛋白和體外干物質消失率的影響

24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發酵液內菌體蛋白濃度分別較對照組升高12.48%、30.37%和24.95%（P＜0.01），并隨添加量增加呈線性升高。

24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ體外干物質消失率分別較對照組升高 1.42%、8.74%和 12.31%（P＜0.05），并隨添加量增加呈線性升高。

3　討論

3.1CPH對奶牛瘤胃體外發酵的影響產氣量的變化與揮發性脂肪酸產量和微生物蛋白合成的變化呈正相關（Krishnamoorthy 等，1991），產氣量和干物質消失率越高，飼料利用率越高。本試驗中，添加CPH處理產氣量和干物質消失率都顯著高于對照組，可能與菌體蛋白濃度和揮發性脂肪酸產量增加有關。可見添加CPH有利于飼料在瘤胃內的降解，提高飼料利用率。

pH、VFA和NH3-N濃度是評價瘤胃發酵的重要參數（Wanapat等，1999）。當pH長時間低于6.2時，瘤胃內纖維素降解菌降解纖維素的能力會下降，嚴重時會導致奶牛瘤胃酸中毒（Erdman等，1982）。本試驗中，隨著CPH添加量的增大，pH呈現下降趨勢，但一直維持在6.58～6.67，有利于瘤胃發酵。pH降低的主要原因可能是TMR中加入CPH后促進了瘤胃微生物活動，增加了發酵液中VFA的含量。VFA的主要作用是為反芻動物提供能量，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。瘤胃內部分細菌、真菌和原蟲的主要發酵產物為乙酸、丙酸和丁酸，且瘤胃內纖維素酶降解纖維的主要產物為乙酸。本試驗中，添加CPH提高了總揮發酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量，可能是由于瘤胃內微生物相對菌群數量和纖維素酶含量的增加所致。王文娟等（2011）研究發現，在肉牛日糧中添加大豆肽顯著提高了瘤胃內VFA含量，與本試驗結果趨勢相近，隨著CPH添加量的增加VFA含量呈遞增趨勢。研究表明，牛奶中乳糖含量與瘤胃內丙酸含量呈正相關（Miller-Webster等，2002），且乙酸和丁酸為合成牛奶中脂肪的前體物質。因此，我們推測CPH對奶牛產奶性能有一定的潛力。NH3-N是瘤胃內氮代謝的主要產物，原蟲和部分蛋白降解菌通過降解日糧中的蛋白質產生NH3-N，并為瘤胃微生物合成菌體蛋白提供原料。NH3-N在瘤胃內含量一般處于動態平衡，研究發現，瘤胃內NH3-N含量適宜范圍為15～30 mg/100 mL（Wanapat等，1999）。本試驗中，添加不同水平的CPH可以提高菌體蛋白含量并在合理范圍內提高NH3-N含量，這可能與原蟲和某些蛋白降解菌相對菌群數量增加有關。有研究指出，瘤胃內原蟲和蛋白降解菌相對菌群數量的增加會引起NH3-N含量增加（Sun等，2013），為微生物提供氮源，從而使菌體蛋白含量增加。王文娟等（2011）對瘤胃灌注小肽對肉牛瘤胃發酵與營養物質消化代謝的影響發現，大豆小肽可以提高瘤胃內菌體蛋白和NH3-N濃度。說明添加CPH可以提高瘤胃NH3-N的含量，提供氮源，進而促進瘤胃微生物合成菌體蛋白。

3.2CPH對纖維素酶活的影響羧甲基纖維素酶又稱內切葡聚糖酶，這類酶可作用于纖維素內部非結晶區，從高分子內部任意切開β-1，4糖苷鍵，產生帶有非還原性末端的小分子纖維素；水楊苷酶又稱外切葡聚糖苷酶或纖維二糖酶，這類酶可以將短鏈的非還原性末端纖維二糖殘基逐個切下降解晶體纖維素。這兩類纖維素酶活性的強弱，可間接說明瘤胃內纖維降解程度。瘤胃內纖維降解菌可以產生纖維素酶，主要用于分解纖維素。本試驗中，添加不同水平的CPH羧甲基纖維素酶活性無明顯變化，但水楊苷酶活性顯著高于對照組，主要原因可能是CPH使瘤胃內某些纖維降解菌相對菌群數量增加所致，其具體機理仍需進一步研究。劉春龍等（2006）研究表明，從絲蘭屬植物中提取出的一種具有生物活性的物質絲蘭皂苷可以提高瘤胃內纖維素酶活，并隨添加水平的升高而增強，與本試驗結果相似。說明添加CPH可以提高瘤胃內纖維類物質的降解率，從而提高纖維在消化道內的消化率。

4　結論

本試驗結果表明，TMR中添加CPH可以改善瘤胃發酵，提高瘤胃內纖維素酶活性，從而提高飼料利用率，其中以添加0.24 g/L為宜。

[1]程茂基，盧德勛，王洪榮，等.不同來源肽對培養液中瘤胃細菌蛋白產量的影響[J].畜牧獸醫學報，2004，35（1）：1 ～ 5.

[2]劉春龍，李忠秋，孫海霞.絲蘭皂甙對綿羊瘤胃酶活及日糧養分48 h降解率的影響[J].西北農林科技大學學報:自然科學版，2006，34（4）：28 ～ 31.

[3]劉晶，劉建新.飼料果膠對瘤胃微生物菌群和發酵特性及蛋白質合成的影響[J].中國畜牧雜志，2014，50（23）：93 ～ 98.

[4]童輝，欒新紅，寧志利，等.玉米蛋白多肽對昌圖豁眼鵝屠宰性能及臟器系數的影響[J].中國家禽，2009，31（10）：8 ～ 10.

[5]王夢芝.不同蛋白質飼料對瘤胃微生物體外發酵和群體結構的影響[J].動物營養學報，2009，21（5）：673 ～ 679.

[6]王文娟，萬發春，楊維仁，等.瘤胃灌注大豆小肽對肉牛瘤胃發酵的影響[J].動物營養學報，2011，23（8）：1324 ～ 1331.

[7]王加啟.反芻動物營養學研究方法 [M].現代教育出版社，2011.145～147.

[8]王文娟.瘤胃灌注小肽對肉牛瘤胃發酵與營養物質消化代謝的影響：[碩士學位論文][D].山東泰安：山東農業大學，2011.

[9]許瑞雪，劉曉蘭.玉米蛋白水解物對生雞肉糜脂質氧化的影響[J].中國調味品，2016，41（8）：5 ～ 10.

[10]Erdman R A，Hemken R W，Bull L S.Dietary sodium bicarbonate and magnesium oxide for early postpartum lactating dairy cows：effects on production，acid-base metabolism，and digestion[J].J Dairy Sci，1982，65（5）：712 ～ 731.

[11]Gunawardana P，W u G，Yuan K，et al.Effect of dietary protein and peptide in corn-soy diets on hen performance，egg solids，egg composition and egg quality of hy-line w-36 hens during second cycle phase three[J].Inte JPoulSci，2009，8（4）：317 ～ 322.

[12]Krishnamoorthy U，Steingass H，Menke K H.Prelim inary observations on the relationship between gas production and microbial protein synthesis in vitro[J].Arch AnimNutr，1991，41 （5）：521 ～526.

[13]Luo J，Zhang W，Yan L I，et al l.Treatment of corn peptide on antioxidant system damage of hepatic tissue in m icrowave radiated rats[J].Chin JVetMed，2014，9：26 ～ 27.

[14]M iller-WebsterT，Hoover W H，Holt M，et al.Influence of yeast culture on rum inalm icrobialmetabolism in continuous culture[J].JDairy Sci，2002，85（8）：2009 ～ 2014.

[15]Sun P，W ang JQ，Deng L F.Effectsof Bacillus SubtilisNatto on m ilk production，rumenfermentation and ruminalm icrobiome of dairy cows[J].Animal，2013，7（2）：216 ～ 222.

[16]W ang M，Meng XY，Yang RL，et al.Cordycepsm ilitaris polysaccharides can enhance the immunity andantioxidation activity in immunosuppressed mice[J].CarbohydrPolym，2012，89（2）：461 ～466.

[17]W anapatM，Pimpa O.Effect of rum inal NH3-N levelson rum inal fermentation，purine derivatives，digestibility and rice straw intake in swamp buffaloes[J].Asian Austral JAnimSci，1999，12 （6）：904 ～907.