淺析基因檢測技術(shù)

劉 燕 許友強(qiáng) 周婷婷 劉明珠 李雨艷

（吉林金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司實(shí)驗(yàn)診斷部，吉林長春 130000）

在眾多基因檢測技術(shù)中，測序技術(shù)無疑是最為直觀、準(zhǔn)確的方法之一，并且隨著基因檢測在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的不斷應(yīng)用發(fā)展，其檢測技術(shù)也在不斷進(jìn)步，從第1代測序技術(shù)至今已經(jīng)發(fā)展到了第4代測序技術(shù)[1]。本文旨在對基因檢測技術(shù)的發(fā)展歷程及4代測序技術(shù)的基本原理和醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行淺析。

1 第1代測序技術(shù)

目前為止，第1代測序技術(shù)是指由Sanger于1977年發(fā)明的雙脫氧末端終止法測序，也稱Sanger測序。其基本原理是，用放射性同位素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引入雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），它與普通的脫氧核苷酸（dNTP）不同，不能合成磷酸二酯鍵，迫使DNA鏈立即停止延長，其合成反應(yīng)也將終止，通過調(diào)節(jié)ddNTP 和dNTP的比值可以得到不同長度的片段，最后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對合成的各個大小的片段進(jìn)行分離，得到整個片段的序列信息。到了20世紀(jì)80年代，用熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記，發(fā)展為熒光自動測序技術(shù)，到了20 世紀(jì)90 年代，毛細(xì)管電泳技術(shù)和微陣列毛細(xì)管電泳技術(shù)發(fā)展迅速，出現(xiàn)了帶有熒光標(biāo)記的毛細(xì)管電泳測序方法，使得測序技術(shù)在效率和安全性上有了顯著的提高。

2 第2代測序技術(shù)

第2代測序技術(shù)亦稱下代測序技術(shù)，可以同時將幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行測序，全面細(xì)致的對基因組進(jìn)行測序，因此又叫深度測序，與第1代測序技術(shù)相比是一場劃時代的變革[2]。第2代測序技術(shù)主要采用邊合成邊測序的基本原理，可以在測序反應(yīng)正在反應(yīng)的同時收集測序信號，主要是將基因組DNA片段連接上通用接頭，然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)合成大量的多克隆序列，進(jìn)而平行測序，經(jīng)生物信息學(xué)技術(shù)計算后獲得完整的序列信息，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，鑒定是否存在基因突變，SNP 位點(diǎn)等，從而診斷相應(yīng)的疾病。

第2代測序技術(shù)和第1代測序技術(shù)相較，具有通量高，自動化程度高，測序速度高，成本低等優(yōu)勢，是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的一類測序技術(shù)。其在臨床診療方面的應(yīng)用也非常廣泛，檢測基因突變可用于腫瘤的診斷（肺癌基因熱點(diǎn)突變和融合檢測、實(shí)體腫瘤關(guān)鍵基因熱點(diǎn)突變和融合檢測、結(jié)直腸癌/肺癌組織樣本中突變熱點(diǎn)檢測等）；遺傳性疾病篩查（線粒體疾病、遺傳性耳聾及神經(jīng)肌肉障礙等）；染色體非整倍體無創(chuàng)產(chǎn)前篩查：胎兒的染色體異常遺傳病中最主要的就是染色體非整倍體，其中以21三體（唐氏綜合征）、18三體（愛德華氏綜合征）和13三體（Patau綜合征）為主要形式，現(xiàn)階段的醫(yī)療水平對于非整倍性染色體病并沒有可靠的治療方案，唯一有效地方法就是對孕婦進(jìn)行產(chǎn)前篩查與診斷；在胚胎植入母體前進(jìn)行遺傳學(xué)的篩查等[3]。經(jīng)過了幾十年的探索和研究，第2代測序技術(shù)在臨床的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟。

3 第3代測序技術(shù)

第3代基因測序技術(shù)主要是以單個分子讀取技術(shù)為原理。包括單分子實(shí)時測序技術(shù)、離子半導(dǎo)體測序技術(shù)、HeliScope單分子測序等技術(shù)[4]。其中最成熟的為SMRT技術(shù)，該技術(shù)的核心是采用零級波導(dǎo)技術(shù)檢測單分子熒光信號。熒光標(biāo)記的dNTP與模板結(jié)合形成磷酸二酯鍵，3’端標(biāo)記上熒光基團(tuán)，在DNA 聚合酶的作用下被切去，其熒光信號經(jīng)ZMW檢測，ZMW 芯片上有許多小孔，直徑只有數(shù)十納米，遠(yuǎn)短于激光的波長，使激光無法穿過小孔，并在光線照射時呈現(xiàn)指數(shù)衰減的消逝波，但可以將激發(fā)的小于波長的熒光局限在小孔內(nèi)，且DNA 聚合酶結(jié)合在小孔內(nèi)進(jìn)而形成一個檢測的空間，檢測激發(fā)的熒光信號，只有靠近基質(zhì)的熒光信號會被保留，消除背景熒光的干擾，根據(jù)得到的熒光信號光譜來區(qū)分不同堿基，進(jìn)而得到DNA 序列。

第3代測序技術(shù)在第2代測序技術(shù)基礎(chǔ)上增加了讀長，而且不經(jīng)PCR技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，直接進(jìn)行邊合成邊測序，因此縮短了測序時間，降低了試劑成本，而且不受胞嘧啶和鳥嘌呤含量的影響。第3代測序技術(shù)的讀長優(yōu)勢可彌補(bǔ)第2代測序技術(shù)的不足，其在臨床上可以用于病毒基因組的研究，對經(jīng)病毒侵染的疾病在治療中具有重要意義；與第1、第2代測序技術(shù)相比，在某些醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，如對遺傳學(xué)領(lǐng)域中SNP位點(diǎn)檢測及甲基化識別具有很高的分辨率；在RNA的檢測方面也有廣泛應(yīng)用，對于在21三體綜合征的檢測中具有重大意義，根據(jù)第3代測序技術(shù)的miRNA測定可以提高診斷的正確率。

4 第4代測序技術(shù)

第4代測序技術(shù)也可稱為納米孔的單分子測序技術(shù)，該技術(shù)主要是采用電信號原理進(jìn)行序列測定的，用于DNA測序的納米孔有生物的納米孔以及固態(tài)的納米孔兩種，生物納米孔，又叫跨膜蛋白通道，有α-溶血素納米孔和蛋白納米孔，固態(tài)納米孔有石墨烯納米孔、聚合物膜和其他混合材料。第4代測序技術(shù)利用不同堿基具有不同的電學(xué)性質(zhì)，通過納米孔直接對堿基穿過電極時的電信號進(jìn)行測量，進(jìn)而識別堿基的排列順序。原理主要為DNA一端與特殊的蛋白相連，使DNA 的正義鏈和反義鏈先后通過納米孔，由于ATCG 這4 種堿基電學(xué)性質(zhì)不同，穿過納米孔的時候電流變化量也不同，通過對電信號的改變進(jìn)行解析，得到DNA序列。

第4代測序技術(shù)是一類測序的新方法，將電子傳導(dǎo)的技術(shù)與單分子的檢測技術(shù)相結(jié)合，摒棄了PCR 擴(kuò)增和洗脫DNA的過程，盡可能規(guī)避了在實(shí)驗(yàn)過程中造成的誤差，并且具有更高通量、更長讀長、更短測序時間、更低成本和更簡單的數(shù)據(jù)分析等優(yōu)勢[5-6]。在應(yīng)用方面，第4代測序技術(shù)可以用于RNA 測序、檢測單鏈及雙鏈DNA片段、重復(fù)序列及Poly 結(jié)構(gòu)的測定、蛋白質(zhì)的檢測等，在臨床和醫(yī)學(xué)方面，特別是在癌癥上的研究起著領(lǐng)頭羊的作用。

5 結(jié)語

第1代測序技術(shù)仍然是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但其通量低，測序成本高，對于檢測單基因的突變以及通量較少的測序是最優(yōu)的選擇。第2代測序技術(shù)發(fā)展成熟，通量高及成本低，但其主要的弊端是測序長度相對較短。第3代測序技術(shù)采取單分子的讀取技術(shù)，比第2代測序的數(shù)據(jù)讀取速度更加迅速，而且在第2代測序基礎(chǔ)上提高了讀長，但隨之帶來的是測序的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性不高。第4代測序技術(shù)與前3代測序技術(shù)比較，采用納米孔電子傳導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行堿基檢測，可以避免在洗脫和擴(kuò)增的過程中造成的誤差，在成本、速度和通量等方面有了顯著的提高，但其仍面臨很多挑戰(zhàn)，處于發(fā)展中的狀態(tài)[7]。

總之，不同的測序技術(shù)有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，也為臨床檢測提供了更多更方便的選擇，促進(jìn)了臨床醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，有理由相信，基因測序技術(shù)在未來的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)更加發(fā)光發(fā)熱。