產蛋白酶菌的分離鑒定及產酶條件優化

王 鼎， 余 淼， 付洋洋， 郭春華*， 彭忠利， 高彥華

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041；2成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都611130）

蛋白酶存在于動物、植物、微生物中，屬于水解酶類，約占世界酶制劑銷量的60%（馬俊陽等，2014）。在分子生物學和微生物發酵技術快速發展的基礎上，微生物蛋白酶在工業上的應用越來越普遍，雖然很多微生物蛋白酶被大量用于飼料工業和畜牧生產，但是大量的研究都集中在單胃動物的生產性能方面（李東東等，2015），而反芻動物方面的研究較少。目前研究已經發現，反芻動物瘤胃中含有10種以上的瘤胃真菌，能產生蛋白酶的共有6種，并且6種均具有氨基酸活性的內切酶。可見，反芻動物瘤胃內的真菌在開發新型蛋白飼料、提高動物飼料利用率、降低飼料成本上具有巨大潛力。

本研究旨在從肉牛瘤胃液中分離出產蛋白酶的霉菌，篩選出產蛋白酶活性較高的菌株，對其產酶條件進行優化，為此菌株更好的應用于畜牧生產提供理論依據。

1　材料與方法

1.1菌株及培養基 菌株來源：從成都市青白江唐家寺肉牛屠宰場的肉牛瘤胃中采集瘤胃液，四層紗布過濾后帶回實驗室備用。選擇性培養基：淀粉8 g，葡萄糖15 g，酵母提取物1 g，蛋白胨6 g，KH2PO43g，MgSO40.5g，瓊脂 15g，蒸餾水 1000mL。

發酵培養基：麥麩與水以質量比1∶1配制而成，自然pH。

酪蛋白培養基：酪蛋白15 g，Na2HPO42 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g。

查氏培養基： 蔗糖 30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·4H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂15 g，定容至 1000 mL，pH 6.0 ～ 6.5。

LB液體培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂糖 10 g，定容至 1000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻后加AMP 1 μL/mL，4℃保存備用。

LB固體培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂糖 10 g，定容至 1000 mL，115 ℃滅菌 20 min，冷卻至 60 ℃左右，加 AMP 1 μL/mL、IPTG 1 μL/mL、X-gal 2 μL/mL， 倒平板后 4 ℃保存備用。

1.2產蛋白酶菌的分離純化 用滅菌生理鹽水將瘤胃液梯度稀釋，取 10-3、10-5、10-6梯度的稀釋液100 μL涂布選擇性初篩平板，30℃倒置培養36 h后挑取單菌落劃線培養。將劃線培養后的菌株點種于酪蛋白培養基平板，30℃倒置培養48 h，測定產生水解透明圈的菌落HE值（HE值=透明圈直徑/菌落直徑）后4℃保存備用。吸取1 mL產生透明圈的菌株孢子懸液接種于發酵培養基中，攪拌均勻，30℃培養72 h后測定蛋白酶活力。

1.3產蛋白霉菌的鑒定 綜合HE值和酶活性兩個指標，選出蛋白酶活性最高的一株進行形態鑒定、分子鑒定。

1.3.1形態鑒定 形態鑒定主要通過 《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》的描寫，再根據菌株生長情況對其進行判斷。

1.3.2分子鑒定 將產蛋白酶菌在30℃、150 r/min的條件下進行擴大培養，培養 3 d后的菌絲體5000 r/min離心5 min。無菌水沖洗2～3遍后，用濾紙吸干水放入液氮中快速冷凍。將凍好的菌體放入研缽中研磨至很細的粉末狀，放入離心管中備用。依據天根柱式真菌試劑盒說明書提取菌株DNA基因組。

以菌株DNA基因組為模版，擴增菌株的18S rDNA基因片段。所用引物為P1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC -3' 和 P2：5' -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'，反應條件為95℃預變性10 min；93℃變性 1 min；56℃退火 1 min；73℃延伸2 min，共30個循環；70℃延伸5 min。取5 μL PCR產物電泳檢測，紫外凝膠成像系統觀察結果。按照AxyPrep DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段，然后將其連接至PMD-19T載體，AMP+挑選陽性菌落，后交送上海英濰捷基公司測序。

1.4單因素試驗 選擇接種量、培養溫度、培養時間作為影響蛋白酶活性的主要因素，通過單因素試驗選取響應面試驗的水平。

1.4.1不同接種量對蛋白酶活性的影響 將初始菌液按1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%的接種量接種，30℃培養48 h，測蛋白酶活力。

1.4.2不同培養溫度對蛋白酶活性的影響 以4%接種量接種，培養溫度分別為26、28、30、32、35、37℃，培養48 h，測蛋白酶活力。

1.4.3不同培養時間對蛋白酶活性的影響 以4%接種量接種，30℃培養，培養時間分別為24、36、48、54、60、72、76 h，測蛋白酶活力。

1.5響應面法優化試驗 根據單因素試驗結果，以接種量、培養時間、培養溫度為自變量，以蛋白酶活性為響應值，進行中心組合試驗設計（陳琳，2011）。每個試驗重復3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。

表1　試驗因素水平及編碼表

1.6數據處理 用Microsoft Excel 2010對數據進行初步整理，用Design Expert 7.0軟件進行響應面分析，用SPSS18.0進行方差分析及差異顯著性分析。

2　結果與分析

2.1產蛋白酶菌的分離純化 瘤胃稀釋液經選擇性初篩平板30℃培養36 h后，共分離純化出34株菌，分別命名為A1～A34。其中產生酪蛋白水解圈的菌株共17株，測定HE值，如表2所示，其中菌株A18的HE值最大。

表2　產蛋白酶菌株初篩

將HE值較大的6株菌，發酵培養后測定其蛋白酶活性，如表3所示，綜合HE值和蛋白酶活性，選擇A18進行形態及分子鑒定。

2.2形態鑒定 將A18菌株涂布于平板中，進行形態觀察。該菌在查氏培養基上生長較快，培養24 h左右菌落直徑可達2～3 cm，菌落起初呈白色羊毛狀，有的略有放射狀溝紋，慢慢變黃繼而變成黃褐色或綠褐色孢子，菌株衰老后，顏色變暗，背面淡褐色，且有褶皺。顯微鏡下觀察發現，此菌株菌絲相當發達，不但有隔膜，而且菌絲頂端能直接產生孢子梗，并且分生孢子是串生的特征。根據《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》的描述，初步判定A18為米曲霉。

表3　菌株的復篩

2.3分子鑒定

2.3.118S rDNA PCR擴增 以A18菌株基因組DNA為模板，P1、P2為引物，進行PCR擴增。擴增產物進行電泳檢測，結果如圖1所示，PCR產物大約1800 bp，為一條單帶。

圖1　18S rDNA PCR產物電泳圖

2.3.2序列分析 測序結果顯示，A18菌株18S rDNA全長1800 bp，在NCBI的Blast中進行比對，結果與GenBank中登陸的Aspergillusniger contig An03c0100，genomic contig（AM270052.1）、Aspergillusoryzae DNA for 18S rRNA，partial sequence （AM270051.1）、Aspergillusoryzae RIB40 DNA，SC206（AP007173.1）序列相似性均為 99%，確定A18為米曲霉。

2.4單因素試驗

2.4.1接種量對菌株A18產蛋白酶活性的影響由圖2可見，蛋白酶活性隨著接種量的增加而呈現增加的趨勢，在4%時達到最大值，之后隨著接種量增加呈下降趨勢。因此，在接種量為4%時，蛋白酶活性最高。

圖2　接種量對菌株產蛋白酶活性的影響

2.4.2培養溫度對菌株A18產蛋白酶活性的影響 由圖3可知，隨著溫度的升高，蛋白酶活性增加，在30℃時活性達到最大。但繼續隨著溫度升高，蛋白酶活性逐漸降低。所以，在溫度為30℃時，酶活性最高。

圖3　培養溫度對菌株產蛋白酶活性的影響

2.4.3培養時間對菌株A18產蛋白酶活性的影響由圖4可知，開始階段，酶活性很低且增長緩慢，36 h后蛋白酶活性隨時間的增加呈增大趨勢，且在60 h達到最大。60 h之后，蛋白酶活性急劇下降，所以，在培養時間為60 h時，酶活性達到最大。

圖4　培養時間對菌株產蛋白酶活性的影響

2.5響應面優化結果

2.5.1回歸模型的建立及方差分析 采用中心組合試驗設計，方案及結果見表4。用Design Expert軟件對表中數據進行多元擬合，得到A18蛋白酶活力 Y 對接種量（X1）、培養溫度（X2）、培養時間（X3）的多項回歸方程為：Y1=372.34+49.17X1+102.58X2+ 91.06X3+34.75X1X2+44.61X1X3-

表4　響應面試驗設計與試驗結果

對上述回歸模型進行方差分析，如表5所示，雖然X12系數不顯著，但是三因素交互差異極顯著，且該模型相關系數R2=0.9884，說明該回歸方程與實際情況擬合度良好，利用該方程來代替實際試驗點進行分析具有合理性。

表5　回歸模型方差分析

2.5.2兩因素對蛋白酶活性的響應面分析 用Design Expert軟件對表4數據進行多元回歸擬合，所得到的兩因素交互的響應面三維圖及等高線圖，如圖5～7所示。

圖5　接種量與溫度交互作用對蛋白酶活性影響的響應面三維圖及等高線圖

從圖5可以看出，該響應面存在最高點，說明在試驗所選擇的接種量與溫度范圍內，存在使米曲霉A18蛋白酶活性達到最大的值，這個值就是該響應面的最高點。在時間為48 h時，接種量與溫度對蛋白酶活的交互作用顯著，接種量為2.7%～4%，溫度為27～29℃時，蛋白酶活性較高。等高線圖為橢圓形，說明接種量與溫度對米曲霉A18產蛋白酶的交互作用明顯。

由圖6可以看出，在接種量為3%時，溫度與時間對蛋白酶活的交互作用顯著，溫度為27～29℃，時間為54～60 h時，蛋白酶活性較高。而且從圖中可以看出該響應面存在最高點，說明在試驗所選擇的溫度與時間范圍內存在一個使米曲霉A18蛋白酶活性達到最大的值，這個值即是此響應面的最高點，也是等高線中最小橢圓的中心點。等高線圖為橢圓形，說明溫度與時間對米曲霉A18產蛋白酶的交互作用明顯。

從圖7可以看出，該響應面存在最高點，說明在試驗所選擇的接種量與時間范圍內，存在一個使米曲霉A18蛋白酶活性達到最大的值，這個值即是此響應面的最高點，也是等高線中最小橢圓的中心點。在溫度為30℃時，接種量與時間對蛋白酶活的交互作用顯著，接種量為3%～4%，時間為54～60 h時，蛋白酶活性較高。等高線圖顯示為橢圓形，說明接種量與時間對米曲霉產蛋白酶的交互作用明顯。

2.5.3回歸模型的驗證 通過Design Expert 7.0得出米曲酶A18的最佳產酶條件為接種量3.67%、溫度28.57℃、培養時間54.59 h。在此條件下，菌株A18中性蛋白酶活力最大。為簡化試驗，在接種量4%、溫度29℃、時間55 h的條件下進行重復試驗，測定中性蛋白酶活性為527.57 U/mL。

3　討論

圖7　接種量與時間的交互作用對蛋白酶活性影響的響應面三維圖及等高線圖

鑒定霉菌通常通過形態鑒定和生理生化分析（楊亞晉等，2013；宋鵬，2012），但此種方法往往只能判斷到微生物的屬水平，不能準確地對微生物進行分類鑒定。通過分子生物學技術對微生物進行鑒定，能充分反映物種之間的同源性，鑒定到種水平。本文通過形態鑒定與分子鑒定相結合的方法，確定A18菌株為米曲霉。對于蛋白酶活性測定方法來說，先通過酪蛋白水解圈法進行產蛋白酶菌初篩，選出產蛋白霉菌共16株，測定其HE值，并以此作為菌株產蛋白霉菌能力的初步鑒定，但HE值不能作為蛋白酶活高低的準確依據，所以本文挑選出HE值較大的6株菌，紫外分光光度法測定蛋白酶活，綜合HE值和蛋白酶活比較，選出酶活最高的A18菌株，酶活性為415.82 U/mL。這與徐建國（2010）（最高酶活 129.2 U/mL）、李曹龍（2012）（最高酶活41.653 U/mL）、 吳麗娜 （2017）（最高酶活49.21 U/mL）等研究相比，酶活要高出很多，這對將來此菌用于生產具有重大的意義。

合適的培養條件對微生物生長、繁殖、代謝有很大影響，試驗先通過單因素試驗研究接種量、培養溫度和培養時間三個因素對菌株A18產蛋白酶活性的影響。結果表明，接種量為4%，培養溫度為30℃，培養時間為60 h時，A18的蛋白酶活性最高。接種量過低，菌株無法在培養時間內產生足夠的孢子數；接種量過高，孢子大量繁殖，在培養基營養物質一定的情況下，菌株的生長受到抑制，這兩方面的因素都不利于蛋白酶的產生和積累，導致蛋白酶活性降低。溫度也是產酶條件的重要影響因素之一。隨著溫度的升高，蛋白酶活性增加，到30℃時活性達到最大；再繼續增加溫度，蛋白酶活性開始降低。出現這一結果的原因可能是溫度過高會導致酶的失活，從而影響酶活性的大小。培養時間的長短影響著微生物的生長，培養時間過短，微生物生長緩慢，酶的合成較少；反之，由于培養時間過長，營養物質的消耗以及代謝產物的積累都會影響微生物的生長。

單因素試驗結果并不能直接準確得出最佳產酶條件，所以本研究在單因素試驗的基礎上采用響應面法設計優化試驗。采用該試驗方案測定數據，得到回歸方程，對此回歸模型進行方差分析，利用所得回歸方程進行預測，如表5所示，回歸模型與實際情況擬合較好。Design Expert設計響應面三維圖顯示，在溫度一定的情況下，隨著接種量的增加，蛋白酶活性提高，但到達極值時，又有下降的趨勢；在接種量為固定值時，蛋白酶活隨溫度升高而增加，到達極值，呈下降趨勢，說明二者對蛋白酶活性提高是有交互作用，當接種量在最高水平附近、溫度在中間值附近時，可以提高蛋白酶活性。

4　結論

本試驗從肉牛瘤胃液中初篩選出34株菌，其中A18菌株蛋白酶活達415.82 U/mL。通過A18菌株18S rDNA序列比較，結合形態特征，確定其為米曲霉。經連續多次重復優化試驗，確定最佳產酶條件為接種量4%、培養溫度29℃、培養時間55 h，其最高酶活可達527.57 U/mL，比優化之前提高了22.6%。

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