散發性結直腸癌患者錯配修復蛋白表達情況以及微衛星不穩定性與Rb蛋白表達的相關性研究

陳浩林，彭昌兵，杜鎮鴻，魏　賢

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，居惡性腫瘤發病的第4位。據相關數據表明，結直腸癌的發病率有逐年上升的趨勢，嚴重威脅著人們的健康和生活質量[1-2]。結直腸癌的發生過程十分復雜，同時牽涉多個腫瘤相關基因的參與[3-4]。臨床研究發現，參與結直腸癌發生的分子途徑主要有染色體不穩定性(CIN)與微衛星不穩定性(MSI)[5]。而在結直腸癌患者中CIN途徑占80%左右，而導致CIN發生因素主要為癌基因和抑癌基因突變，經過多階段、多因素而致癌[6]。MSI主要是由錯配修復基因缺陷造成，目前發現的錯配修復蛋白(MMRP)共有7種，但主要研究其中4種(MLH1、PMS2、MSH2和MSH6)，而這些蛋白水解后的產物均為核酸水解酶，這種水解酶能糾正DNA復制過程中錯配的堿基，使基因在復制過程中更具有保真性[7-8]。此外，還有研究表明錯配修復基因與腫瘤患者某些臨床病理特征存在一定的相關性[9]。因此，本文以60例散發性結直腸癌作為研究對象，研究MMRP表達以及MSI與視網膜母細胞瘤(Rb)蛋白表達的相關性。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年1月—2016年1月我院存檔的手術切除散發性結直腸癌標本60例，其中男32例，女28例；年齡36～69(49.51±8.41)歲。①納入標準：根據患者臨床癥狀以及相關病理檢查，確診為散發性結直腸癌。②排除標準：符合Amsterdam Ⅱ診斷標準的遺傳性非息肉病性結直腸癌(HNPCC)；在手術前行放化療的患者。

1.2研究方法標本采用10%甲醛固定、常規脫水、取材、石蠟包埋、HE染色。根據HE切片選取病灶區域，用記號筆定位。用采樣針從標記好的蠟塊組織中取2～4 mm長的組織條，打入42孔(6×7)蠟塊微陣列中。其中第1行后2個孔作為空白對照及定位標識。

1.3指標檢測采用免疫組織化學染色法對MLH1、PMS2、MSH2、MSH6以及Rb蛋白進行染色，采用羅氏全自動免疫組化儀執行；MLH1、PMS2、MSH2、MSH6以及Rb抗體均由中杉金橋公司提供。將4種MMRP中的1種以上表達陰性定為MSI。

1.4判斷標準每張切片選取陽性率高的區域10個高倍視野，每個視野計數100個細胞。①MMRP各蛋白表達檢測：MLH1、PMS2、MSH2和MSH6均在細胞核內表達，采用半定量積分法檢測。陽性檢測評分標準：0分表示無陽性細胞、1分表示陽性細胞占≤10%、2分表示陽性細胞占10%～50%、3分表示陽性細胞占50%～80%、4分表示陽性細胞所占比例>80%。染色強度評分標準：0分為無色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色。兩項評分相乘為最終評分，最終評分為0分表示蛋白缺失、1分表示為蛋白低表達、≥2分表示蛋白陽性表達，缺失與蛋白低表達按照陰性表達計算。②Rb蛋白表達檢測：Rb蛋白在細胞核中表達，表達陽性表示細胞核呈黃色或棕黃色。

2　結果

2.1MMRP和Rb蛋白的表達情況MLH1陽性54例，陰性6例；PMS2陽性52例，陰性8例；MSH2陽性59例，陰性1例；MSH6陽性58例，陰性2例；MSI患者10例(16.67%)。Rb蛋白陰性表達25例(41.67%)，陽性表達35例(58.33%)。

2.2MSI和Rb蛋白表達與臨床特征的關系MSI與年齡、腫瘤部位、Dukes分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織類型存在相關性(P<0.05)。Rb蛋白表達與組織類型、遠處轉移、浸潤深度、大體分型存在相關性(P<0.05)。見表1。

2.3相關性分析MSI患者Rb蛋白表達陰性4例、陽性6例。經Spearman相關分析顯示，MSI與Rb蛋白表達呈正相關(r=0.427，P<0.001)。

3　討論

目前有關結直腸癌的發病原因尚未完全清楚，但有文獻報道，結直腸癌的發病機制與KRAS基因突變有關，檢測其表達情況對結直腸癌的診斷與治療具有一定的價值[10]。而臨床上研究最多的結直腸癌是HNPCC，且結果表明其與錯配修復基因的種系發生突變有著密切的相關性，并且有接近15%的HNPCC與散發性結直腸癌患者有著相同的發病機制[11]。近年隨著醫療技術的發展，臨床研究逐漸向更細化方向進行，MMRP是目前臨床上關注的熱點，其在生物進化過程中充當著重要的角色[12-13]。人體DNA的復制是一項十分精細的過程，在此過程中往往會有堿基錯配情況發生，此時引發MMRP的表達，來識別與修復錯配的堿基，從而維持基因組的穩定性，若是MMRP發生缺陷導致不能完整表達和修復錯配的堿基時，會使DNA突變頻率加快，從而導致腫瘤的發生[14-16]。

MMRP總共有7種，但是目前臨床上研究最多的是MLH1和MSH2，其表達的缺失與自身甲基化的發生有著密切的關系，并且這兩種蛋白的表達情況對MSI有較好的預測價值[17-18]。國外學者Pai等[19]研究表明，在子宮內膜癌患者中約有20%的患者存在MLH1蛋白的缺失，并且缺失率明顯高于PMS2蛋白。于鵬飛等[20]學者研究證明，散發性結直腸癌存在MLH1、MSH2、MSH6蛋白的高度缺失，并且其表達水平與患者的臨床病理參數存在明顯的相關性。本研究結果顯示，其中MLH1陽性54例，陰性6例；PMS2陽性52例，陰性8例；MSH2陽性59例，陰性1例；MSH6陽性58例，陰性2例；MSI患者10例(16.67%)；提示4種蛋白的突變情況與散發性結直腸癌的發生、發展有著密切的相關性。而于靜等[21]學者研究顯示，不同地區的散發性結直腸癌患者缺失蛋白所占的比例有所不同，且發生突變的基因也有所不同。本研究還表明，MSI與年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、淋巴結轉移、Dukes分期、組織類型存在相關性。這與彭俊玲等[22]和趙喜連等[23]學者的研究結果相似。

表1　MSI和Rb蛋白表達與散發性結直腸癌患者臨床病理特征的關系[例(%)]

注：MSI為微衛星不穩定性，Rb為視網膜母細胞瘤

Rb蛋白是1986年才分離出現的第一個抑癌基因，分為非磷酸化與磷酸化兩種形式。非磷酸化時為Rb蛋白的活化形式，對細胞的生長起到負調節作用。磷酸化Rb蛋白主要是讓分裂后的子細胞處于G1期，抑制腫瘤細胞的轉移，是目前臨床上判斷腫瘤是否發生轉移的重要指標。而相關臨床研究已證實在乳腺癌組織中能檢測到Rb蛋白[24]。本研究結果顯示，Rb蛋白表達與大體分型、組織類型、遠處轉移、浸潤深度存在相關性，提示Rb蛋白對腫瘤發生和轉移具有預測作用。鄭文等[25]研究也表明，Rb蛋白的表達與腫瘤的轉移、浸潤具有密切的相關性，對腫瘤預后具有重要的評估價值。且本研究還表明，MSI與Rb蛋白表達呈正相關，表明在臨床上可通過檢測Rb蛋白的表達情況評估MSI散發性結直腸癌患者的預后情況。

綜上所述，在散發性結直腸癌患者中存在MMRP缺失，并且MLH1、PMS2缺失較MSH2和MSH6多見；MSI與Rb蛋白表達呈正相關，且與散發性結直腸臨床病理特征關系密切，對散發性結直腸癌的預測以及惡性程度的評估具有參考價值，可能參與散發性結直腸癌的發生、發展過程。

[參考文獻]

[1]李道娟,李倩,賀宇彤.結直腸癌流行病學趨勢[J].腫瘤防治研究,2015,42(3):305-310.

[2]張東,魏壽江.趨化因子CXCL12及其受體CXCR4與結直腸癌肝轉移的相關性研究進展[J].保健醫學研究與實踐,2016,13(2):87-92.

[3]李博倫,陳小嵐.結直腸腺瘤發病相關因素及癌變機制的研究進展[J].解放軍醫藥雜志,2015,27(10):108-111.

[4]李延東,姜訓忠,耿正偉,等.聯合檢測血清CEA、AFP、CA19-9對結直腸癌的診斷價值[J].解放軍醫藥雜志,2015,27(5):53-55.

[5]黃莎,楊建偉.晚期結直腸癌的分子機制和治療策略[J].臨床與病理雜志,2017,37(5):1066-1072.

[6]馮瀅瀅,丁建華,趙克.散發性結直腸癌的分子機制研究進展[J].實用腫瘤學雜志,2015,29(5):471-475.

[7]封革,陳慧敏,胡萍,等.雷替曲塞對微衛星高度不穩定的結腸癌細胞凋亡的作用及臨床意義[J].中國臨床研究,2016,29(12):1610-1613.

[8]畢蕊,涂小予,肖遙星,等.子宮內膜癌錯配修復蛋白表達的臨床病理分析[J].中華病理學雜志,2016,45(5):302-307.

[9]岳欣,胡均,王家倉.非轉移性結直腸癌組織中MMR的表達狀態及意義[J].山東醫藥,2017,57(9):9-11.

[10] 張釗,劉勝利.KRAS基因突變與結直腸癌研究進展[J].東南大學學報:醫學版,2016,35(1):154-157.

[11] 閆志輝,崔立紅,浦江,等.結直腸癌及腸道腺瘤性息肉患者腸道菌群失調情況及相關危險因素分析[J].解放軍醫藥雜志,2017,29(5):25-29.

[12] 張曉云,張春雁,王延文,等.結直腸癌DNA錯配修復蛋白的表達及臨床病理學意義[J].中國醫藥生物技術,2016,11(2):123-127.

[13] 王靜,鐘子劭,林益群,等.hMSH2和hMSH6蛋白在散發性結直腸癌中的表達及意義[J].現代消化及介入診療,2016,21(5):678-681.

[14] 丁一波,杜琰,王顥,等.非可控性炎癥、表觀遺傳和遺傳改變在結直腸癌發生和侵襲過程中的作用[J].第二軍醫大學學報,2015,36(4):362-366.

[15] Yaeger R, Shah M A, Miller V A,etal. Genomic alterations observed in colitis-associated cancers are distinct from those found in sporadic colorectal cancers and vary by type of inflammatory bowel disease[J].Gastroenterology, 2016,151(2):278-287.

[16] 肖植濤,張榮欣,趙陽,等.散發性結直腸癌患者錯配修復蛋白表達與臨床病理特征的關系[J].中華醫學雜志,2017,97(16):1248-1251.

[17] 吳波,楊秀峰,白化天.散發性結直腸癌微衛星不穩定與hMHL1和hMSH2基因突變的研究[J].中國現代普通外科進展,2015,18(10):775-779.

[18] 陳海濱,張國志,李曙光,等.hMLH1、hMSH2和hMSH6在結直腸癌中的表達及臨床意義[J].臨床誤診誤治,2015,28(6):85-88.

[19] Pai R K, Plesec T P, Abdul-Karim F W,etal. Abrupt loss of MLH1 and PMS2 expression in endometrial carcinoma: molecular and morphologic analysis of 6 cases.[J].Am J Surg Pathol, 2015,39(7):993-999.

[20] 于鵬飛,顧國利,魏學明,等.hMLH1、hMSH2、hMSH6在散發性結直腸癌中的表達狀態與其臨床病理特征的關系[J].中國普外基礎與臨床雜志,2015,22(5):581-585.

[21] 于靜,張曉瑩,趙峰,等.新疆維吾爾族及漢族散發性結直腸癌中hMLH-1、hM-SH-2差異性表達及臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志,2015,31(10):1085-1088,1094.

[22] 彭俊玲,湯濤,葉祖祿,等.散發性結直腸癌微衛星不穩定狀態與錯配修復蛋白表達缺失及臨床病理特征的相關性[J].中國腫瘤生物治療雜志,2015,22(4):479-483.

[23] 趙喜連,郗彥鳳,白文啟,等.錯配修復蛋白和p53蛋白表達與結直腸癌的臨床病理關系及其相關性[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(4):370-374,379.

[24] 周興,陶振超,錢立庭.乳腺癌中HPV與p53、Rb蛋白表達的關系及對預后的影響[J].現代腫瘤醫學,2015,23(15):2152-2155.

[25] 鄭文,鄭建云,劉冰,等.乳腺癌組織中人乳頭狀瘤病毒與Rb、P53蛋白表達、預后的相關性分析[J].山西醫科大學學報,2016,47(11):1026-1031.