miR-29b與Mcl-1蛋白表達的關系及其對肺癌細胞增殖和凋亡的影響

楊　雁，劉行仁，蔣才玉，吳　池，鄒　俊

隨著新藥和靶向治療的進展，肺癌的治療方式也趨于多元化，使其5年生存率得到顯著的提高[1-2]。盡管如此，由于缺乏對肺癌早期篩查的有效手段，以及缺少預測肺癌危險因素的分子標記物，其治療效果始終沒有達到預期的標準[3]。近期的研究發現，miR-29家族在調節腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學行為中發揮作用[4]。miR-29的家族成員的在白血病、黑色素瘤、肝癌、結腸癌、宮頸癌和肺癌中都表現出低表達[5-10]。Fabbri等[11]研究發現，miR-29的家族成員能靶向調控DNA甲基轉移酶3A和3B，這兩種酶在DNA甲基化的過程中起到至關重要的作用，而且與肺癌患者的生存也有一定聯系。miR-29的重新表達能使肺癌細胞恢復正常的DNA甲基化模式，也使得再沉默甲基化的腫瘤抑制基因(如FHIT和WWOX)重新表達，最終達到抑制腫瘤生成的目的。Rothschild等[12]證實了miR-29b參與Src-ID1信號傳導通路，起到減弱肺癌細胞遷移和侵襲能力的目的。因此，基于miRNA的靶向治療模式，miR-29b成為了一位極具競爭力的候選者。髓細胞白血病因子-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)蛋白是一種多區的抗凋亡蛋白，屬于B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白家族的一員，在肺癌中起到了重要的促癌效應，但其上游的調控因子卻無法明確[13]。本研究的目的在于探究miR-29b在非小細胞肺癌中的表達情況以及與Mcl-1相互作用關系，并分析其對肺癌細胞生物學行為的影響。

1　材料與方法

1.1組織樣本收集2016年10月—2017年3月在四川省人民醫院進行肺癌切除術患者的腫瘤組織和癌旁正常組織18例，病理類型均為非小細胞肺癌。所有患者術前均未接受其他治療。其中男14例，女4例；年齡51～72歲，中位年齡61歲。本研究通過醫院醫學倫理委員會的批準同意。取出的腫瘤組織和癌旁正常組織樣本立即經液氮冷凍并儲存在-80℃冰箱待測。

1.2細胞株和實驗試劑人非小細胞肺癌株SPC-A1由武漢細胞生物研究所提供。RPMI-1640培養液、10%小牛血清、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素、0.25%胰酶溶液購自Gibco公司，二甲基亞砜購自Sigma公司。細胞培養于含有10% FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養基，37℃的5% CO2培養箱中，生長至80%左右濃度時進行傳代和凍存，用于后續的實驗。細胞培養瓶和24、96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。Trizol購自美國Ambion公司，Mcl-1抗體購買于美國abcam公司。逆反轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，PCR試劑盒購自美國Kapa公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成。miR-29b mimics和inhibitor購自GenePharma(中國上海)。

1.3SPC-A1細胞分組將200 μl含有100 pmol miR-29b mimics的無血清、無抗生素培養基與含5 μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)的200 μl相同培養基混合，并靜置20 min。然后將所得的400 μl轉染溶液加入含有1.6 ml培養基的每個孔中。6 h后，用補充有10%FBS和青霉素及鏈霉素的2 ml新鮮培養基代替培養物。同樣方法處理miR-29b inhibitor和miR-29b control。將分別轉染miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和miR-29b control的SPC-A1細胞，分為miR-29b mimics組、miR-29b inhibitor組和對照組。

1.4定量聚合酶鏈反應(PCR)使用Trizol試劑提取非小細胞肺癌細胞株以及肺癌組織和癌旁正常組織的總RNA，并使用TM miRNA分離試劑盒(Ambion, Austin, TX, USA)進一步純化miRNA部分。通過超微量分光光度計測定RNA樣品的濃度和純度。使用實時PCR系統進行實時逆轉錄PCR。miR-29b前引物：5'-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3'，后引物：5'-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3'；Mcl-1克隆的前引物：5'-CGGGGTACCGAGTCATACTTGTGAAG-3'，后引物：3'-GCACTCGAGCCTGTTTTTGTTTGATG-5'。U6管家基因作為對照。以100 ng總RNA為模版，逆轉錄cDNA，反應條件：95℃ 10 min，45個循環；95℃變性10 s，60℃退火和延伸60 s。使用RQ=2-ΔΔCt方法計算非小細胞肺癌細胞株以及肺癌組織和癌旁正常組織的miRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.5Western blotting實驗檢測Mcl-1蛋白SPC-A1細胞用冰PBS洗滌，然后用蛋白質裂解物(Pierce, Rockford, IL, USA)裂解。在4℃下以5000×g離心15 min，用二亞鉻酸蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度。按照說明書配制10% SDS-PAGE分離膠，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST充分沖洗后，使用1∶1000稀釋一抗孵育(兔單克隆Mcl-1抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶2500)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發光。實驗重復3次。

1.6雙熒光素酶實驗使用雙熒光素酶實驗驗證miR-29b和Mcl-1的關系。將SPC-A1細胞接種與24孔板中，與0.4 mg螢火蟲熒光素酶報告載體和0.1 mg含有海腎螢光素酶的pRL-TK對照載體共轉染，根據siPORTneoFX使用方法操作，在轉染后48 h制備裂解物。轉染24 h后使用雙熒光素酶報告基因測定系統測定熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.7MTT增殖實驗將對數期SPC-A1細胞使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以1×103個細胞/孔的密度接種到96孔板中。在細胞培養7 d后，加入MTT測定液20 μl，每孔充分混合均勻，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在細胞培養24、48、72和96 h進行MTT測定波長為490 nm時的吸光度(OD)，計算SPC-A1細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.8細胞凋亡實驗使用Annexin V-Fluos染色試劑盒(Roche-Boehringer)檢測SPC-A1細胞的凋亡情況。SPC-A1細胞應用PBS洗滌，并根據試劑盒說明書進行染色。將載玻片與Permafluor介質一起安裝，并在熒光顯微鏡(Axiophot; Olympus, Tokyo, Japan)下觀察。

2　結果

2.1肺癌組織和癌旁正常組織miR-29b的表達肺癌組織和癌旁正常組織miR-29b表達水平分別為0.56±0.13和1.68±0.24。肺癌組織miR-29b表達水平明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2SPC-A1細胞miR-29b的表達miR-29b mimics組SPC-A1細胞miR-29b的表達水平為6.15±0.76，miR-29b inhibitor組為0.52±0.24，對照組為1.10±0.19。miR-29b mimics組SPC-A1細胞miR-29b的表達水平高于對照組(P<0.05)，miR-29b inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.3miR-29b對SPC-A1細胞增殖的影響在培養72 h和96 h時，miR-29b mimics組的OD值分別為0.56±0.02和0.65±0.07，對照組分別為0.64±0.03和0.78±0.05。miR-29b inhibitor組培養96 h時的OD值為0.86±0.01。培養72 h和96 h時，miR-29b mimics組的增殖活性顯著低于對照組(P<0.05)。培養96 h時，miR-29b inhibitor組的增殖活性明顯高于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1　miR-29b對SPC-A1細胞增殖的影響 與對照組比較，aP<0.05

2.4miR-29b對SPC-A1細胞凋亡的影響miR-29b mimics組、miR-29b inhibitor組和對照組SPC-A1細胞凋亡率分別為(37.28±5.11)%、(9.25±1.26)%和(21.69±7.38)%。miR-29b mimics組SPC-A1細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，miR-29b inhibitor組低于對照組(P<0.05)。

2.5miR-29b靶向調控Mcl-1的表達生物信息學軟件預測結果顯示，miR-29b與Mcl-1有類似的3'-UTR結合序列。雙熒光素酶實驗結果顯示，轉染miR-29b mimics后可以明顯抑制Mcl-1的熒光素酶活性。Western blotting實驗結果顯示，miR-29b mimics組、miR-29b inhibitor組和對照組Mcl-1蛋白表達水平分別為0.42±0.12、1.89±0.07和1.02 ±0.02。miR-29b mimics組Mcl-1蛋白表達水平低于對照組(P<0.05)，miR-29b inhibitor組高于對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2miR-29b和Mcl-1之間的關系以及miR-29b對Mcl-1蛋白表達的影響

A.miR-29b和Mcl-1的結合位點；B.雙熒光素酶檢測miR-29b和Mcl-1之間的關系；C.miR-29b對Mcl-1蛋白表達的影響；Mcl-1為髓細胞白血病因子-1

3　討論

miRNA是一類內源性的小RNA，長度通常少于22個核苷酸[14]。miRNA作為一種非編碼RNA，在轉錄后能調控靶RNA的表達[15]。miRNA參與了許多生物學進程，在多種疾病的發生和發展過程中起到關鍵的作用，其中也包括腫瘤，而且在腫瘤中存在明顯的表達差異[16-17]。在一些腫瘤發病過程中，miRNA通過靶向作用某些生物學信號途徑來改變腫瘤細胞的表型，成為腫瘤形成過程中的重要一環，而且還能作為診斷和預測生存預后的分子標記物[18]。基于miRNA治療的發展代表了腫瘤治療的新策略。通過同時調節多種生物信息途徑，miRNA可以作為腫瘤抑制因子或致癌基因，調節腫瘤的發展過程，包括增殖，侵襲，凋亡和轉移等[16]。miR-29b能靶向致癌基因和抗凋亡基因，在多種癌癥發病過程中通常被沉默或下調[19]。在急性骨髓性白血病中，CDK6已被證實為miR-29b直接作用靶點[20]。miR-29b的過表達可預防人乳頭狀瘤病毒介導的宮頸癌細胞的惡性轉化[21]。而在非小細胞肺癌中，miR-29b作用的靶基因為DNA甲基轉移酶3A和3B，且其表達與DNA甲基轉移酶3A和3B表達呈負相關[16]。本實驗結果表明，miR-29b表現出與肺癌較高的相關性，其表達的降低與腫瘤的形成負相關，同時還影響了肺癌細胞的增殖和凋亡，所以能起到了一定的抑癌作用。

Mcl-1是一種抗凋亡蛋白，其表達不足易導致細胞在不適當時機凋亡，而過度表達易引起細胞轉化風險的增加[22]。通常在腫瘤組織中Mcl-1表現為過表達。如Mcl-1的過度表達導致膽管癌細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導的細胞凋亡產生抗性，而其抑制劑使細胞對凋亡敏感[23]。Mcl-1蛋白水平的調節是復雜的，在轉錄層面，Mcl-1 mRNA是由細胞因子白介素-3(IL-3)、IL-5、IL-6、IL-15、IL-22、干擾素-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子和表皮生長因子受體所調控[24]。鑒于Mcl-1調節的復雜性，可能還存在其他的調控機制。最近的研究已經表明，microRNAs能對蛋白質的表達進行調節[25]。miRNA作為內源性序列特異性抑制靶基因翻譯，從而可以降低靶蛋白表達[26]。如miR-15和miR-16有與Bcl-2 mRNA互補性的堿基序列，過表達miR-15和miR-16可導致Bcl-2蛋白減少和細胞凋亡增加[27]。在急性骨髓性白血病、膽管癌和肝細胞癌中，miR-29b已被證明靶向Mcl-1蛋白的表達，影響腫瘤細胞生存[28-30]。本研究結果表明，miR-29b具有和Mcl-1相似的3'-UTR結合序列。雙熒光素酶實驗結果表明，miR-29b能與Mcl-1的3'-UTR特異性結合，并抑制Mcl-1蛋白的表達活性。

綜上所述，肺癌組織中miR-29b的表達水平明顯低于癌旁正常組織，同時miR-29b能抑制肺癌細胞增殖并誘導其凋亡，miR-29b能與Mcl-1的3'-UTR特異性結合，并抑制Mcl-1蛋白的表達活性。miR-29b可以成為肺癌治療的新靶點。

[參考文獻]

[1]石遠凱,孫燕,于金明,等.中國晚期原發性肺癌診治專家共識(2016年版)[J].中國肺癌雜志,2016,19(1):1-15.

[2]De Angelis R, Sant M, Coleman M P,etal. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE-5-a population-based study[J].Lancet Oncol, 2014,15(1):23-34.

[3]Trusolino L. Oncogenic MET as an effective therapeutic target in non-small cell lung cancer resistant to EGFR inhibitors: the rise of the phoenix[J].Cancer Discov, 2016,6(12):1306-1308.

[4]Hilz S, Fogarty E A, Modzelewski A J,etal. Transcriptome profiling of the developing male germ line identifies the miR-29 family as a global regulator during meiosis[J].RNA Biol, 2017,14(2):219-235.

[5]Zaidi S K, Perez A W, White E S,etal. An AML1-ETO/miR-29b-1 regulatory circuit modulates phenotypic properties of acute myeloid leukemia cells[J].Oncotarget, 2017,8(25):39994-40005.

[6]Andrews M C, Cursons J, Hurley D G,etal. Systems analysis identifies miR-29b regulation of invasiveness in melanoma[J].Mol Cancer, 2016,15(1):72.

[7]Mahati S, Xiao L, Yang Y,etal. miR-29a suppresses growth and migration of hepatocellular carcinoma by regulating CLDN1[J].Biochem Biophys Res Commun, 2017,486(3):732-737.

[8]Basati G, Razavi A E, Pakzad I,etal. Circulating levels of the miRNAs, miR-194, and miR-29b, as clinically useful biomarkers for colorectal cancer[J].Tumor Biol, 2016,37(2):1781-1788.

[9]Li Y, Zhang Z, Xiao Z,etal. Chemotherapy-mediated miR-29b expression inhibits the invasion and angiogenesis of cervical cancer[J].Oncotarget, 2017,8(9):14655-14665.

[10] Dinh T K, Fendler W, Chalubinska-Fendler J,etal. Circulating miR-29a and miR-150 correlate with delivered dose during thoracic radiation therapy for non-small cell lung cancer[J].Radiat Oncol, 2016,11:61.

[11] Fabbri M, Garzon R, Cimmino A,etal. MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and 3B[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(40):15805-15810.

[12] Rothschild S I, Tschan M P, Federzoni E A,etal. MicroRNA-29b is involved in the Src-ID1 signaling pathway and is dysregulated in human lung adenocarcinoma[J].Oncogene, 2012,31(38):4221-4232.

[13] Belmar J, Fesik S W. Small molecule Mcl-1 inhibitors for the treatment of cancer[J].Pharmacol Ther, 2015,145:76-84.

[14] Ha M, Kim V N. Regulation of microRNA biogenesis[J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2014,15(8):509-524.

[15] Hansen T B, Jensen T I, Clausen B H,etal. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J].Nature, 2013,495(7441):384-388.

[16] Iorio M V, Croce C M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. a comprehensive review[J].EMBO Mol Med, 2017,9(6):852.

[17] Xie B, Ding Q, Han H,etal. miRCancer: a microRNA-cancer association database constructed by text mining on literature[J].Bioinformatics, 2013,29(5):638-644.

[18] Cheng C J, Bahal R, Babar I A,etal. MicroRNA silencing for cancer therapy targeted to the tumour microenvironment[J].Nature, 2015,518(7537):107-110.

[19] Yan B, Guo Q, Fu F J,etal. The role of miR-29b in cancer: regulation, function, and signaling[J].Onco Targets Ther, 2015,8:539-548.

[20] Zhu K, Liu L, Zhang J,etal. MiR-29b suppresses the proliferation and migration of osteosarcoma cells by targeting CDK6[J].Protein Cell, 2016,7(6):434-444.

[21] Lajer C B, Garnaes E, Friis-Hansen L,etal. The role of miRNAs in human papilloma virus (HPV)-associated cancers: bridging between HPV-related head and neck cancer and cervical cancer[J].Br J Cancer, 2017,117(5):e2.

[22] Xiao Y, Nimmer P, Sheppard G S,etal. MCL-1 is a key determinant of breast cancer cell survival: validation of MCL-1 dependency utilizing a highly selective small molecule inhibitor[J].Mol Cancer Ther, 2015,14(8):1837-1847.

[23] Morton S D, Cadamuro M, Brivio S,etal. Leukemia inhibitory factor protects cholangiocarcinoma cells from drug-induced apoptosis via a PI3K/AKT-dependent Mcl-1 activation[J].Oncotarget, 2015,6(28):26052-26064.

[24] Mojsa B, Lassot I, Desagher S. Mcl-1 ubiquitination: unique regulation of an essential survival protein[J].Cells, 2014,3(2):418-437.

[25] Schmiedel J M, Klemm S L, Zheng Y,etal. Gene expression. MicroRNA control of protein expression noise[J].Science, 2015,348(6230):128-132.

[26] Mork S, Pletscher-Frankild S, Palleja Caro A,etal. Protein-driven inference of miRNA-disease associations[J].Bioinformatics, 2014,30(3):392-397.

[27] Liu J, Chen G, Feng L,etal. Loss of p53 and altered miR15-a/16-1, MCL-1 pathway in CLL: Insights from TCL1-Tg: p53-/-mouse model and primary human leukemia cells[J].Leukemia, 2014,28(1):118-128.

[28] Xu L, Xu Y, Jing Z,etal. Altered expression pattern of miR-29a, miR-29b and the target genes in myeloid leukemia[J].Exp Hematol Oncol, 2014,3:17.

[29] Mott J L, Kobayashi S, Bronk S F,etal. Mir-29 regulates Mcl-1 protein expression and apoptosis[J].Oncogene, 2007,26(42):6133-6140.

[30] Xiong Y, Fang J H, Yun J P,etal. Effects of MicroRNA-29 on apoptosis, tumorigenicity, and prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology, 2010,51(3):836-845.