黃芩苷對前列腺癌細胞生物學行為的影響

高培廷，宋　華

前列腺癌病因復雜，是發展中國家老年男性常見的惡性腫瘤，目前普遍認為遺傳因素和長期的環境暴露是導致前列腺癌發生的主要原因[1-2]。尤其在發展中國家，吸煙和環境污染是前列腺癌發病的高危因素[3-4]。隨著科學技術的發展，對前列腺癌發病分子機制的認識越來越深入，探討更多前列腺癌的診斷和治療方式也是目前的研究熱點。黃芩苷含多種黃酮類化合物，在植物中廣泛存在，人體平日通過攝入不同類型的飲食，對黃酮類化合物的日均攝入量高達1 g，遠遠超過其他維生素類的攝入量，且對人體沒有不良反應[5]。很多學者研究指出類黃酮化合物在人體內具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗血栓形成和抗血管生成等作用[6-7]。而具有生物活性的黃酮類化合物也具有一定的抗腫瘤作用，但是目前研究只專注于少數幾類，主要是異黃酮類。有相關研究表明，異黃酮可以抑制小鼠胃癌細胞的增殖能力，還可以誘導膠質瘤細胞凋亡過程[8]。目前關于黃芩苷對腫瘤細胞的作用研究甚少，且對其在生物體內的活性效應了解也不多。目前，黃芩苷對前列腺癌細胞的生物學行為的影響，以及能否對前列腺癌進行有效治療的研究報道極少。本文通過研究黃芩苷對前列腺癌細胞生物學行為的影響，探討黃芩苷對人前列腺癌細胞增殖和凋亡的作用。

1　材料與方法

1.1細胞株和實驗試劑前列腺癌細胞株PC3購于上海細胞生物研究所，細胞培養于含10%胎牛血清以及100 U/ml青霉素和50 g/L鏈霉素的RPMI1640培養基，置于37℃，5% CO2孵箱內。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海美季生物技術有限公司。黃芩苷粉劑購于南京制藥廠有限公司。

1.2CCK-8細胞活性實驗細胞活性實驗使用CCK-8試劑盒測定。將前列腺癌PC3細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞。將細胞用不同濃度的黃芩苷(5、10、20、25和50 mg/L)與PC3細胞孵育48 h。孵育過后，用PBS沖洗細胞兩次。向每個孔中加入新鮮培養基200 μl，然后加入20 μl的CCK-8溶液，并在37℃下孵育4 h。使用酶標儀板在490 nm波長下測量不同組的吸光度，計算不同濃度黃芩苷對前列腺癌細胞的抑制率。

1.3MTT法檢測細胞增殖活性將前列腺癌PC3細胞分為黃芩苷組和對照組，黃芩苷組用25 mg/L黃芩苷處理，對照組用等量的PBS處理。在兩組細胞對數期使用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸浮液并以每孔1×103個細胞的密度接種到96孔板中。培養7 d后，每孔加入MTT測定液20 μl，充分混合，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用無菌吸管吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，在室溫下攪拌10 min保證晶體充分溶解。然后在24、48、72和96 h測定波長為490 nm時的吸光度，計算前列腺癌PC3細胞的增殖情況。實驗重復3次。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡情況和活性氧(ROS)水平將前列腺癌PC3細胞接種于6孔板內，2 ml/孔，實驗分為黃芩苷組和對照組，黃芩苷組使用25 mg/L黃芩苷處理，對照組則使用等量的PBS處理。每組均設3個復孔，處理48 h后消化細胞，裝于1.5 ml的EP管內，在4℃下以2000 r/min離心15 min，棄上清液，使用PBS輕柔混勻后等速離心，重復洗滌3次。檢測細胞凋亡使用400 μl Bidding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min，然后加入10 μl PI同等條件下孵育5 min，1 h內上流式細胞儀檢測。并通過熒光顯微鏡評估兩組細胞內ROS的水平。

2　結果

2.1黃芩苷對前列腺癌細胞的最適有效濃度通過CCK-8細胞活性實驗檢測黃芩苷對前列腺癌PC3細胞的抑制率情況，確定黃芩苷藥物的最適有效濃度。實驗結果顯示，黃芩苷濃度為5、10、20、25和50 mg/L時對前列腺癌PC3細胞抑制率分別為(11.68±1.18)%、(17.92±2.39)%、(31.95±3.09)%、(57.46±5.31)%和(34.62±2.39)%。黃芩苷濃度為25 mg/L時對前列腺癌PC3細胞抑制率最高(P<0.05)。故以25 mg/L濃度的黃芩苷作為后續實驗濃度。

2.2黃芩苷對前列腺癌細胞增殖能力的影響MTT細胞增殖實驗檢測黃芩苷對前列腺癌PC3細胞增殖能力的影響。實驗結果顯示，對照組在24、48、72和96 h時的前列腺癌PC3細胞增殖率分別為(25.27±7.10)%、(51.06±9.74)%、(78.36±8.32)%和(95.36±11.21)%；黃芩苷組分別為(8.84±3.25)%、(11.26±4.97)%、(15.62±5.09)%和(23.76±5.59)%。在24和48 h時，兩組的前列腺癌PC3細胞增殖率比較差異無統計學意義(P>0.05)。而在72和96 h時，黃芩苷組的前列腺癌PC3細胞增殖率低于對照組(P<0.05)。結果表明，適量濃度的黃芩苷對前列腺癌PC3細胞的增殖能力有明顯的抑制作用。

2.3黃芩苷對前列腺癌細胞凋亡行為的影響細胞凋亡實驗檢測25 mg/L的黃芩苷對前列腺癌PC3細胞凋亡行為的影響。實驗結果顯示，對照組前列腺癌PC3細胞凋亡率為(4.20±0.86)%，黃芩苷組為(26.90±2.48)%。黃芩苷組的前列腺癌PC3細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。見圖1。結果表明，適量濃度的黃芩苷對前列腺癌PC3細胞的凋亡行為有明顯的增強作用。

圖1流式細胞術檢測前列腺癌PC3細胞的凋亡行為變化

2.4黃芩苷對前列腺癌細胞內ROS水平的影響流式細胞術檢測使用25 mg/L濃度的黃芩苷對前列腺癌PC3細胞內ROS水平的變化情況的影響，間接檢測前列腺癌PC3細胞的凋亡水平。實驗結果顯示，對照組前列腺癌PC3細胞中的ROS表達水平為(5.9±1.25)%，黃芩苷組為(38.2±4.12)%。黃芩苷組前列腺癌PC3細胞中ROS表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。見圖2。結果表明，黃芩苷可以加速前列腺癌PC3細胞的凋亡進程。

圖2兩組前列腺癌PC3細胞內活性氧的水平(×400)

3　討論

有研究結果顯示，黃芩苷對部分腫瘤細胞有一定的抑制作用，包括乳腺癌、肝癌及結腸癌[9-10]。但是，某些劑量的黃芩苷對腫瘤細胞的殺傷作用不明顯，而且有明顯的細胞毒性，干擾正常細胞的生長[11]。有研究報道，黃芩苷可有效改善膠質瘤細胞的增殖活力，有效保護原代培養的膠質瘤細胞，減緩外界及體內微環境的誘導損傷，表現出明顯的保護作用[12]。而且Wei等[13]學者研究指出，黃芩苷具有顯著的抗氧化特性和抗炎活性，不僅對腫瘤細胞有抑制作用，對部分炎癥也有緩解效果。本實驗結果顯示，黃芩苷濃度為25 mg/L時，對前列腺癌PC3細胞增殖能力的抑制效果最佳。在一定的濃度范圍，隨著黃芩苷的濃度增加，對前列腺癌PC3細胞增殖能力抑制效果呈正相關關系。在以往的研究中，已經證實黃芩苷可以引起部分細胞的細胞周期發生變化。適量濃度的黃芩苷對細胞的生長過程有一定的干擾作用[14]。而且類黃酮類物質已被證明會改變參與細胞生長和分化關鍵蛋白質的調控過程，包括誘導細胞周期蛋白依賴性激酶和抑制視網膜母細胞瘤磷酸化蛋白的表達[15-16]。

目前，黃芩苷對人前列腺癌的抗腫瘤作用機制尚不完全清楚。有研究通過寡核苷酸微陣列分析表明，黃芩苷可以通過上調多達23個基因蛋白，從而參與各種細胞的生物學活性，包括調節細胞周期和細胞增殖基因(HERG、ras和hst)、細胞凋亡基因(CDKN1A)、信號轉導相關調節因子(ETS2和MAP2)和細胞外基質/黏附分子(MMP73、MMP9)[17-19]。在上述調控因子中，HERG的表達情況與乳腺癌細胞的增殖凋亡相關，MMP9的活化與誘導口腔鱗狀細胞癌的轉移相關[20]。而有相關研究指出，中、高濃度的ROS可以通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡，并發現自由基與細胞信號轉導間存在一定的內在關聯[21]。本研究結果發現，黃芩苷作用于前列腺癌細胞后，細胞內ROS水平明顯上調。表明黃芩苷可以促進前列腺細胞的凋亡，抑制其增殖行為，達到有效的抗腫瘤效果。Won等[22]學者研究顯示，在體外肝轉移癌小鼠的飲食中添加適量的類黃酮類物質具有抑制肝轉移的效果。而且其他研究相繼證明類黃酮類化合物在使用過程中對荷瘤小鼠沒有嚴重的細胞毒性[23]。所以，含有豐富類黃酮的黃芩苷是一種非常理想的有效的抗腫瘤藥物，對腫瘤細胞有明顯的抑制殺傷作用，可以和其他藥物聯用增強治療效果。

綜上所述，合適濃度(25 mg/L)的黃芩苷對前列腺癌細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用，而且暫未發現任何相關不良反應。表明黃芩苷可能對前列腺癌具有一定潛在的抗腫瘤活性，后續實驗應深入探討其在細胞層面的相關機制，為黃芩苷在臨床治療的應用提供理論支持。

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