維生素D受體遺傳變異與急性腦卒中的關聯

鄒王軍, 陸敏艷, 孫　凱

(南京醫科大學附屬江蘇盛澤醫院, 1. 急診科; 2. 神經內科, 江蘇 蘇州, 215228)

急性腦卒中是急診常見病癥之一，其具有高發病率、高死亡率、高致殘率、高復發率以及高醫療負擔的特點[1]。腦卒中作為一個全球性的健康問題，是影響傷殘調整壽命年第3位的原因。腦卒中造成的死亡和殘疾為發展中國家帶來了沉重的經濟負擔。腦卒中主要分為出血型和缺血型兩大類，臨床以缺血型腦卒中最為多見，其發病機制是極其復雜的，從遺傳學角度分析，腦卒中為一組多基因遺傳性疾病，僅少數腦卒中是由單基因遺傳缺陷所引起[2]。心臟和衰老基因組流行病學隊列研究協作組(CHARGE)開展了一項目前最大規模的腦卒中全基因組關聯研究(GWAS)，此項研究結果揭示除一些不明危險因素外，遺傳因素可能是腦卒中發病的重要危險因素[3]。研究[4]已證實，缺乏維生素D可增加腦卒中的發病風險。維生素D與維生素D受體(VDR)相結合后才能發揮生物學功能。VDR遺傳變異與多種心腦血管疾病均有不同程度的關聯，Prabhakar P等[5]在印度人群中發現，VDR基因FokI位點多態性與缺血型腦卒中的發病存在關聯。目前，在我國漢族人群中尚未開展VDR基因遺傳多態與缺血型腦卒中關聯的研究。本研究結合國外已有的研究進展，采用基于醫院的病例對照研究，探討VDR基因遺傳多態與缺血型腦卒中發病的關聯，現報告如下。

1　資料與方法

1.1　一般資料

隨機選取2014年5月—2017年5月在江蘇盛澤醫院急診收治且診斷為急性缺血型腦卒中患者263例為急性缺血型腦卒中組。納入標準: ① 所有病例均經過CT/MRI以及相關實驗室檢查明確診斷; ② 年齡18～70歲; ③ 自愿作為研究對象，保證完成研究過程。排除標準: ① 其他心血管疾病患者; ② 年齡在18歲以下或70歲以上; ③ 合并感染性疾病、腫瘤患者。所有研究均為無血緣關系的人群，且排除孕婦、哺乳婦女者。健康對照組為本單位同時期參加體檢的健康人群591例，按照年齡、性別等因素與口腔癌組相匹配。本研究獲得了本單位倫理委員會的批準，且嚴格遵守倫理學的各項規定。

1.2　調查方法

參照相關文獻自行設計《腦卒中患者調查表》進行現場詢問調查，在研究對象知情同意的前體下由經過培訓的調查人員對研究對象進行詢問調查，調查內容包括基本情況(年齡、性別、吸煙、飲酒等)，既往疾病史(慢性疾病史、傳染病史、其他腫瘤史等)。

1.3　實驗方法

經知情同意后，抽取研究對象EDTA抗凝靜脈血5 mL, 并在24 h內以4 000轉離心10 min, 將靜脈血分離成血清層、白細胞層和紅細胞層，分裝于1.5 mL凍存管，置-20 ℃貯存。血清25(OH)D3水平的檢測采用ELISA法，試劑盒購自南京百斯凱科技有限公司。所有實驗的具體操作均嚴格按照說明書進行。從NCBI、HapMap等數據庫中尋找和確認VDR基因的SNPs位點，選擇在中國人群具有較高頻率(MAF≥5%), 再結合國內外文獻報道，最終確定了FokI和ApaI兩個位點。運用ABI公司設計的TaqMan-MGB熒光探針實時定量PCR法檢測FokI和ApaI位點基因型。探針和引物均委托南京驥驁生物技術公司設計。反應在ABI 7900 PCR儀中進行，采用SDS2.3軟件讀取檢測數據。

1.4　統計學分析

應用EpiData 3.10、SAS 9.1.3、SPSS17.0和PHASE 2.0軟件對調查和實驗數據進行分析，健康對照在和病例組中性別、吸煙、飲酒分布情況采用卡方檢驗，年齡、體質量指數(BMI)分布差異采用t檢驗，血清25(OH)D3水平分布不符合正態分布，故采用秩和檢驗方法。VDR基因位點在人群中分采用多因素Logistic回歸分析。本研究的檢驗均為雙側概率檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1　研究對象的一般情況

本研究共納入263例急性腦卒中患者和591例健康對照者。2組人群在性別和年齡分布上無顯著差異(P=0.07、0.28), 2組人群中吸煙和飲酒人數的分布亦無顯著差異(P=0.09、0.84)。血清25(OH)D3水平在健康對照組中的分布顯著高于急性腦卒中組(P<0.01)。見表1。

表1　急性腦卒中組與健康對照組一般情況的比較

與健康對照組比較, **P<0.01。

2.2　VDR基因多態性與急性腦卒中遺傳易感性的關系

多因素Logistic回歸分析顯示，在調整年齡、BMI等因素后，與FF基因型相比, FokI位點的Ff可以顯著增加個體急性腦卒中的發病風險(調整OR=1.65，95% CI=1.18～2.32); 作者并沒有發現ApaI位點多態性與急性腦卒中發病風險存在顯著關聯。顯性模型顯示，與FF基因型相比，FokI位點的變異基因型Ff/ff可以顯著增加急性腦卒中的發病風險(調整OR=1.61, 95%CI=1.16～2.21), 而ApaI位點Aa/aa基因型與AA相比，并未發現該基因型與急性腦卒中發病風險存在關聯(調整OR=1.17, 95%CI=0.87～1.57)。見表2。

表2　VDR基因多態性與急性腦卒中遺傳易感性的關系[n(%)]

調整因素分別為年齡、BMI、性別、吸煙和飲酒

2.3　單倍型研究

與fa單倍型相比, Fa單倍型在急性腦卒中組的分布顯著低于健康對照組(調整OR=0.66, 95%CI=0.51～0.85), 見表3。

表3　VDR基因SNP位點單倍型分析與急性腦卒中發病的關聯[n(%)]

調整因素分別為年齡、BMI、性別、吸煙和飲酒

3　討　論

維生素D是參與機體多種生理反應、免疫功能的類固醇類衍生物。25(OH)D3是機體維生素D最重要的活性代謝產物，可參與抑制腎素-血管緊張素系統(RAS), 起到降低血壓，保護血管的作用[6]。本研究中，健康對照組的血清25(OH)D3水平顯著高于急性腦卒中組，這與苗偉等[7]的研究結果相同，表明機體血清25(OH)D3水平確與急性腦卒中的發病風險存在關聯，且急性腦卒中患者普遍存在缺乏維生素D的現象，這對急性腦卒中的臨床診斷具有一定的指導意義。

維生素D發揮生物學功能依賴與VDR的結合，而VDR的表達受控于VDR基因多態性。因此，VDR基因多態性可通過影響VDR的表達而調控維生素D的生物學功能。人類VDR基因位于染色體12q13～14, 其cDNA全長約100 kb, 由多個內含子和9個外顯子組成。VDR基因多態性與多種疾病發生均有關聯，包括免疫學疾病、慢性疾病、感染性疾病以及腫瘤等[8]。Saadi A等[9]在一項基于漢族人群的病例對照研究中發現, FokI和BsmI位點多態性與哮喘的發病存在關聯。同樣在漢族人群總，盛正妍等[10]研究發現FokI位點多態性與Ⅰ型糖尿病的發病風險存在關聯。在一項Meta分析研究中, Gao等[11]發現FokI位點ff基因型可增加亞洲人群結核的發病風險。由此可見, VDR基因FokI位點確實與多種疾病的發病風險存在關聯。本研究中，作者發現FokI位點的Ff可以顯著增加個體急性腦卒中的發病風險，其變異基因型Ff/ff亦可顯著增加急性腦卒中的發病風險。然而，未發現ApaI位點多態性與急性腦卒中發病風險存在關聯。在單倍型研究中，作者發現與fa單倍型相比, Fa單倍型在急性腦卒中組的分布顯著低于健康對照組，由此可見, FokI位點多態性在VDR基因變異中發揮著重要作用，且這種作用在一定條件下起到主導作用。印度學者Puttachandra等[5]首次研究了VDR基因FokI、ApaI、TaqI以及BsmI四個位點多態性與急性缺血型腦卒中患者發病風險的研究，結果只發現FokI位點多態性與急性缺血型腦卒中患者的發病風險存在關聯，這一結果與本研究一致。有研究發現, FokI位點多態性與缺血性卒中患者膽固醇水平有關。眾所周知，血脂異常是腦卒中的重要危險因素。因此, VDR基因多態性可能通過影響機體血脂水平，來間接影響腦卒中的發病。

綜上所述，維生素D水平以及VDR基因多態性對急性腦卒中發病風險的作用不可忽視，其可預測急性腦卒中的發病以及影響急性腦卒中發生、發展的臨床結局。

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