響應面法優化腸膜明串珠菌生物合成右旋糖酐工藝條件

袁宇，藍艷禹，黃臣，李媚，廖安平

（廣西民族大學化學化工學院，廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地，廣西高校化學與生物轉化過程新技術重點實驗室，廣西南寧530006）

右旋糖酐是一種具有很高的生物相容性和生物水解性的、由簡單的葡萄糖單元聚合而成的中性細菌胞外多糖[1]，右旋糖酐的基本化學式是 H（C6H10O5）nOH，它是蔗糖在細菌胞外酶右旋糖酐蔗糖酶的作用下生成的一種α-葡聚糖[2]。右旋糖酐產品是一類親水性很強的高分子化合物，合成的方法主要有微生物法和酶法[3]，微生物法合成右旋糖酐的菌主要是嗜中溫或嗜熱細菌如明串珠菌、葡糖桿菌、鏈球菌、乳酸菌等[4-9]。右旋糖酐是第一個商業化的細菌胞外多糖[10]，由腸膜明串珠菌合成的水溶性右旋糖酐廣泛應用于制藥、食品、農業和精細化工等領域[11]，在低分子量藥物的轉化反應中，右旋糖酐的應用可提高藥物的水溶性[12]。2015年4月，在WHO基本藥物清單中，右旋糖酐T70被列為血漿代用品的基本藥物[1]。右旋糖酐的合成受到一系列物理和化學因素的影響，如溶解度、黏度、比旋度以及培養液中的氮、磷離子等[13]。為使右旋糖酐的產量最大化，研究人員已經對生物合成條件進行了優化[14]。據報道，右旋糖酐的分子量大小和產量取決于各種反應過程變量如溫度、蔗糖和受體的濃度等[15]。本試驗采用腸膜明串珠菌（CICC-21725），在單因素試驗基礎上，采用響應面法對合成培養的工藝條件進行優化以提高蔗糖的轉化率，為該菌的應用提供可靠數據。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

腸膜明串珠菌CICC-21725：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

無水乙醇、蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、瓊脂粉（均為生物試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司；乙腈（色譜純）：德國默克公司；水：自制二重蒸餾水。

1.2　儀器與設備

LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；LT-XT搖床：瑞士Kuhner AG；ACB-4A1垂直流超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；SZ-97自動三重二次蒸餾水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；LC20AD RID-10A高效液相色譜儀：日本島津。

1.3　試驗方法

1.3.1　培養基的配制

種子培養基組份（g/L）：蔗糖130，蛋白胨2.0，磷酸氫二鈉1.4，磷酸二氫鉀0.3。

發酵培養基組份（g/L）：蔗糖 80，蛋白胨 7.0，磷酸氫二鈉1.4，磷酸二氫鉀0.3。

1.3.2　液相色譜條件

色譜柱：Polaris 5 NH2柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫公司；流動相：乙腈/水=78∶22（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測器溫度：40℃；進樣量：20L。

1.3.3　蔗糖標準曲線的繪制

將蔗糖干燥至恒重后稱取0.5g（精確至萬分之一），用75%乙腈（體積比）定容至50 mL，蔗糖標準儲備液的濃度為10mg/mL，稀釋配制一系列濃度的蔗糖溶液，用0.22 μm的有機系針式過濾頭過濾，放置備用。

1.3.4　轉化過程中蔗糖的質量計算

從種子培養基中取10%（質量比）的種子液于發酵培養基中，以接種時刻為0點取樣，之后每3個小時取樣，用流動相稀釋定容后在液相色譜中對蔗糖濃度進行分析，蔗糖質量的計算按照式1計算：

式中：m為取樣時轉化液中蔗糖的質量，g；m1為轉化液的質量，g；c為從標準工作曲線上得到的被測組分的濃度，mg/mL；V為樣品溶液定容體積，mL；m0為所取得轉化液的質量，g。

蔗糖轉化率按照式2計算：

式中：m初為接種時轉化液中蔗糖的質量，g；m終為反應12 h后轉化液中蔗糖的質量，g；m′為取出樣品中蔗糖的質量，g。

2　結果與分析

2.1　蔗糖標準曲線

按照1.3.3中的試驗方法，以峰面積/10 000為橫坐標，蔗糖濃度為縱坐標，用origin擬合出蔗糖的標準曲線如圖1所示。

由圖1（a）可知：當蔗糖濃度在0.04 g/L～2.0 g/L時，線性回歸方程為Y=0.051 02X+0.002 62，其中R2=0.999 94；由圖1（b）可知：當蔗糖濃度在 0.8 g/L～10.0 g/L時，線性回歸方程為Y=0.049 08X+0.056 51，其中R2=0.999 94。

圖1　蔗糖標準曲線Fig.1　Standard curve of sucrose

2.2　轉化過程中蔗糖的質量變化

按照1.3.4中方法對腸膜明串珠菌轉化液進行取樣分析，采用式（1）計算不同時間轉化液中的蔗糖質量，結果見圖2。

圖2　不同時間轉化液中的蔗糖質量Fig.2　The quality of sucrose at different time culture liquid

由圖2可知，在接種前期蔗糖質量變化較為平緩，6 h～12 h之間蔗糖質量急劇下降且12 h時基本轉化完全，12 h后變化平緩且最終為0。這是因為接種前期是腸膜明串珠菌生長的潛伏期，故變化不大，6 h后進入生長對數期，這時菌體快速生長蔗糖消耗極快，12 h后進入平穩期。因此，后續試驗以12 h作為反應終點對蔗糖轉化率進行分析。

2.3　單因素試驗

2.3.1　蔗糖濃度對蔗糖轉化率的影響

改變發酵培養液中蔗糖濃度為 50、60、80、90、100 g/L，蛋白胨、Na2HPO4、KH2PO4分別為 7、1.4、0.3g/L，以接種時為轉化起點，在28℃、150 r/min搖床反應器中轉化12 h后取樣分析，考察蔗糖濃度對蔗糖轉化率的影響，結果如圖3所示。

圖3　蔗糖濃度對蔗糖轉化率的影響Fig.3　The change of sucrose concentration on the influence of sucrose conversion

由圖3可知，當蔗糖濃度不超過80 g/L時，在12 h內蔗糖基本能夠轉化完全，轉化率較高；后隨著蔗糖濃度的增大，蔗糖轉化率降低，這是因為發酵液中過高的蔗糖濃度會影響菌體的生長，所以選擇蔗糖濃度為80 g/L。

2.3.2　搖床轉速對蔗糖轉化率的影響

按照1.3.1中配制腸膜明串珠菌的發酵培養基，調節培養液pH值為7.1，反應溫度28℃，搖床轉速分別為 0、50、100、150、200 r/min，以接種時為轉化起點培養12 h后取樣，試驗結果如圖4。

圖4　搖床轉速對蔗糖轉化率的影響Fig.4　The change of shaking speed on the influence of sucrose conversion

由圖4可知，搖床轉速對蔗糖轉化率影響較小，低轉速時蔗糖轉化率較高，隨著轉速的升高，蔗糖轉化率略有降低。搖床轉速主要通過改變培養液中的溶氧量及傳質過程來影響腸膜明串珠菌，氧氣過多時會抑制其生長，增大搖床轉速會增大發酵液中的溶氧量和物質之間的剪切力從而影響菌體生長，因此蔗糖轉化率有所降低，綜合考慮，轉速選擇100 r/min。

2.3.3　溫度對蔗糖轉化率的影響

按照1.3.1中配制腸膜明串珠菌的發酵培養基，調節培養液pH值為7.1，搖床轉速150 r/min，培養溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃，以接種時為轉化起點培養12 h后取樣，試驗結果如圖5。

圖5　溫度對蔗糖轉化率的影響Fig.5　The change of temperature on the influence of sucrose conversion

由圖5可知，溫度變化對蔗糖轉化率影響較大，隨著溫度的升高蔗糖轉化率先增大后減小，在30、35℃時蔗糖轉化率較高。溫度主要通過影響右旋糖酐蔗糖酶的活性來影響蔗糖轉化率，溫度過低會使得酶催化反應速率變慢，過高會使酶變性或失活，因此后續反應溫度選擇30℃。

2.3.4　初始pH值對蔗糖轉化率的影響

按照1.3.1中配制腸膜明串珠菌的發酵培養基，調節培養液 pH 值分別為 6.1、6.5、7.1、7.6、8.0，搖床反應條件28℃，150 r/min，以接種時為轉化起點培養12 h后取樣，試驗結果如圖6。

圖6　初始pH值對蔗糖轉化率的影響Fig.6　The change of initial pH on the influence of sucrose conversion

由圖6可知，蔗糖轉化率隨初始pH值的升高先增大后降低且在pH值為7.1的時候有最大值。pH值的變會化引起菌體細胞膜電荷發生改變而影響菌體的生長，同時pH值變化會影響右旋糖酐蔗糖酶的活性。后續反應中初始pH值選擇7.1。

2.4　響應面法優化腸膜明串珠菌發酵工藝條件

在上述單因素試驗的基礎上，采用響應面法考察蔗糖濃度、搖床轉速、溫度、初始pH值對蔗糖轉化率的交互影響，以蔗糖轉化率為響應值Y，設計四因素三水平響應面試驗，試驗設計見表1。

表1　響應面試驗因素及水平表Table 1　Factors and levels of response surface method

表2　響應面設計及試驗結果Table 2　The design of experiment and result of response surface

通過Design Expert軟件對表2中試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到下列二次多元回歸方程：

對上述二次多元回歸模型進行方差分析，結果見表3。

表3　回歸模型方差分析表Table 3　Variance analysis for the regression model

由表3可知，回歸擬合模型（Pr＞F）值＜0.000 1，擬合模型極顯著；實驗的失擬項（Pr＞F）=0.069 9＞0.05，差異不顯著，表示此模型合理且不再引入更高次的項；模型擬合系數R2為0.999 5，調整R2為0.999，擬合模型能闡明99.9%的響應值的改變。變異系數為0.54%，較小，說明擬合模型置信度較高。因此擬合模型用于右旋糖酐合成的培養工藝條件分析和預測是可靠的。由表3中F值大小可知，各因素對右旋糖酐收率影響強度為C＞A＞B＞D。因素A、B、C、D的交互作用與產率的響應面及其等高線見圖7。

圖7　各因素交互作用響應面曲線圖Fig.7　Response surface of various factors interaction

圖7為各因素之間兩兩交互作用的響應面曲線圖，從圖7及表3中可知，CD因素交互作用不顯著，AB、AC、AD、BC、BD因素之間交互作用顯著。從圖7可以看出初始pH值和溫度的交互作用對蔗糖轉化率的影響最大，隨著初始pH值和溫度的增大蔗糖轉化率也隨之增高。本試驗分析優化得到的最佳培養工藝條件為蔗糖濃度69.58g/L、初始pH 6.92、溫度30.95℃、搖床轉速153.21 r/min，考慮到實際操作的可行性，調整后的培養工藝條件為蔗糖濃度70 g/L、初始pH 7.0、溫度30℃、搖床轉速150 r/min。

2.5　驗證試驗

根據響應面試驗結果，按照蔗糖、蛋白胨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀濃度分別為70、7.0、1.4、0.3 g/L配制腸膜明串珠菌發酵培養基，調整初始pH值為7.0，高溫滅菌后接入10%（質量比）種子液，在搖床溫度30℃，轉速150 r/min條件下轉化培養12 h，采用高效液相色譜法對培養液中的蔗糖進行定量。進行3次平行試驗，結果表明蔗糖轉化率為99.18%。

3　結論

通過腸膜明串珠菌（CICC-21725）培養工藝條件的單因素試驗及Box-Behnken響應面設計試驗和分析得到右旋糖酐的培養工藝條件為：蔗糖濃度70 g/L、初始pH 7.0、溫度30℃、搖床轉速150 r/min。配置腸膜明串珠菌培養基，在優化的培養工藝條件下反應12 h，對轉化液中的蔗糖含量進行分析，得到蔗糖的轉化率為99.18%，平行試驗的相對誤差較小，說明該條件可行且具有實際操作意義。

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