乳酸桿菌作用下香蕉抗性淀粉的體外發酵研究

白永亮，凌志洲，林燕丹，夏雨

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528000；2.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山528437）

一個健康成人體內的微生物細胞數量共有1014個，其中大量的微生物寄居在腸道中[1-2]。乳酸桿菌通常定植在人或動物的口腔和腸道中，屬于革蘭氏陽性無芽孢菌，一般為細長的桿狀、大多呈鏈狀排列[3]。作為腸道內最有利的一種益生菌，乳酸桿菌對人體的正常代謝活動、營養吸收起到非常重要的作用。乳酸桿菌可以通過其代謝產物降低腸道的pH值，從而抑制有害菌生長，具有減少體內毒素，保護腸道黏膜，調節機體免疫力，并預防一些胃腸道疾病的發生[4]。

人體超過50%人的飲食熱量來源于淀粉基質食品，而淀粉基質食品的質量和數量直接影響到人體血糖與體內代謝平衡?？剐缘矸郏≧esistant starch，RS）的發現被認為是最近二十年來碳水化合物在人體健康應用方面的重大進展[5]。抗性淀粉又稱抗酶解淀粉及難消化淀粉，在人體小腸中不被消化吸收，在大腸內被微生物利用發酵產酸，同時厭氧微生物降解有機質產生代謝物用于菌體生長，引起微生物菌群的變化[5-7]。近年來的研究已初步證明，RS在大腸被生理性細菌發酵產生多種短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFA）和氣體，有助于降低大腸pH值，減少結腸癌發病率，抑制致病菌生長和繁殖[8]，同時促進腸道內益生菌的生長和繁殖[9-10]。SCFAs對宿主能能產生重要的生理作用，如降低胞內pH值，促進礦物質吸收，減少結腸內次級代謝產物膽汗酸的生成，以及影響大腸內微生物菌群分布等[11-14]。在SCFAs中，丁酸是大腸細胞優先的能量來源，能抑制腸癌細胞的擴散[11]，研究發現其與糖尿病、結腸癌和肥胖有關[5，15-20]。

抗性淀粉可分為4種類型：RS1是物理包埋淀粉，RS2天然抗性淀粉，RS3是回生淀粉和RS4是化學改性淀粉[21]。不同來源抗性淀粉在腸道中發酵情況不同，謝濤[22]等研究了4種淀粉樣品都能促進短鏈脂肪酸（SCFAs）總量的增加，其中土豆回生淀粉（RS3）、交聯淀粉（RS4）與 Novelose 230（RS2）特別有利于促進丁酸的生成。土豆回生淀粉（RS3）與交聯淀粉（RS4）能夠改善人體腸道菌群的分布、促進SCFAs特別是丁酸的生成。青香蕉富含天然抗性淀粉，以其致密的顆粒結構和晶體結構而不能被人體小腸消化吸收，被認為是第二類型的抗性淀粉（RS2）[23]。本試驗模擬香蕉抗性淀粉在小腸液、胃液中的消化過程，研究消化后香蕉抗性淀粉對乳酸桿菌的生長繁殖影響以及乳酸桿菌對香蕉抗性淀粉的體外發酵作用，為益生菌制劑提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

青香蕉：廣州華工市場；EMB瓊脂培養基、腸道增菌肉湯：青島高科園海博生物技術有限公司；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標準品，正己烷（色譜純）、乳酸檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2　儀器與設備

5975-7890型氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠；UV3010分光光度計：日本日立公司；DGG-9070B電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1　香蕉抗性淀粉的制備

選擇采前8成～9成熟的青香蕉，徹底清洗干凈后去皮，切片并置于一定比例的VC、檸檬酸和亞硫酸氫鈉護色液中浸10 min，將香蕉肉與護色液按一定比例（1∶2）混合后打漿，4 000 r/min離心15 min。取沉淀在50℃烘干，打粉后過100目篩制得香蕉抗性淀粉，密封備用。

1.3.2　消化液的制備

分別配制人工胃液和人工腸液。

1.3.2.1　人工胃液配制

取稀鹽酸（9.5%～10.5%）10 mL，加蒸餾水稀釋至體系pH值為1.5左右。然后按照1 g/100 mL的質量濃度比加入胃蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.20 μm微孔濾膜過濾除菌，即得人工胃液。

1.3.2.2　人工小腸液配制

取磷酸二氫鉀6.8 g，用900 mL水溶解后，再用0.4%的氫氧化鈉溶液調pH值至6.8左右，然后分別加入10 g胰蛋白酶和10 g胰淀粉酶，充分溶解后，最后加水定容至1 000 mL，用孔徑0.20 μm微孔濾膜過濾除菌，備用。

1.3.3　消化模擬

采用Jenkins[24]提出的In-Vitro消化模型進行消化模擬試驗。分別稱取一定量的青香蕉淀粉浸入人工胃液、人工小腸液中，置于37℃水浴中振蕩。隔一定時間取樣，利用滲析袋模擬人體腸道來分離淀粉的消化產物，并將滲析袋內的殘留物低溫（50℃以下）烘干后干燥保存備用。

1.3.4　乳酸桿菌的富集培養

取健康大鼠糞便，將糞便樣品按質量比1∶10的比例接入已滅菌的生理鹽水，充分震蕩，用四層無菌紗布過濾，制成樣品液，梯度稀釋后接種于EMB培養基，接種量為1 mL。于37℃厭氧培養48 h，選擇性培養乳酸桿菌。選擇性培養后，分別接種于9 mL腸道增菌肉湯（EE），37℃富集培養24 h。

1.3.5　香蕉抗性淀粉對乳酸桿菌生長繁殖的影響

取菌液1 mL，加入到裝有9 mL PBS緩沖液（pH7.4）的EP管中，混勻。然后，按菌落計數的方法梯度稀釋，取1 mL接種于添加有胃液和小腸液消化后香蕉抗性淀粉（20 g/L）的EMB選擇性培養基上，培養一定時間后菌落計數，以不添加香蕉抗性淀粉為空白對照組，觀察菌落生長狀況。

1.3.6　建立體外發酵模擬試驗

上述富集培養結束后，立即取菌液接種于含胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉的發酵培養基。分別厭氧培養 0 、4、8、12、16、20 h 后，測定其管內溶液 pH值，同時將管內培養液轉移入已滅菌的15 mL聚乙烯管，加入0.5 mL 2%CuSO2溶液將菌殺死，于-20℃保存，測定短鏈脂肪酸和乳酸。

1.3.7　短鏈脂肪酸的提取及檢測[25]

發酵液離心（3 000 r/min，15 min）。吸取5 mL上清液，14 mL 0.36 mol/L HClO4和 13.5 mL 1 mol/L NaOH，劇烈振蕩。加入2.5 mL 5 mol/L磷酸，劇烈振蕩。加入15 mL 1%濃H2SO4的甲醇溶液，70℃回流30 min。然后加入15 mL冷的正己烷提取。吸取1 μL有機層，上柱分析。

氣相色譜測定條件：載氣為N2，分流比80∶1，流速64 mL/min。采用 ZB-WAX，30 m×250 μm×0.25 μm。檢測器為FID，檢測器溫度為260℃。升溫程序：50℃保持5 min，然后以5℃/min升溫到100℃，再以20℃/min升溫到180℃，共運行19 min。

1.3.8　乳酸檢測

1.3.8.1　樣品預處理

將樣品發酵液、培養液用生理鹽水稀釋到適當濃度，使測定絕對OD值（測定OD-空白OD）在0.05～0.35之間。

1.3.8.2　測定操作

按表1加樣混勻后，于530 nm，1 cm光鏡，雙蒸水調零，測定各管吸光值。乳酸測定見表1。

表1　乳酸測定Table 1　Determination of lactic acid

1.3.8.3　乳酸含量計算

2　結果與分析

2.1　香蕉抗性淀粉對乳酸桿菌生長繁殖的影響作用

2.1.1　香蕉抗性淀粉對乳酸桿菌的生長狀況的影響

圖1為香蕉抗性淀粉對乳酸桿菌生長狀況的影響，香蕉抗性淀粉已經過胃液和小腸液消化處理，空白對照培養基不添加香蕉抗性淀粉。

圖1　乳酸桿菌的生長狀況Fig.1　The growth of lactobacillus

由圖1可看出，添加香蕉抗性淀粉后，乳酸桿菌的數量明顯增加。由此可知，香蕉抗性淀粉有利于乳酸桿菌的生長繁殖，可作為其碳源利用。雖然目前關于抗性淀粉是如何促進腸道菌群生長的，還未知其分解機理。但根據我們前期的研究發現，經腸道菌利用后的淀粉顆粒表面明顯形成了空洞，這證明了抗性淀粉確實作為腸道菌的唯一碳源被利用。此外，還有可能是前期的人工胃液和小腸液的處理，促進了抗性淀粉可被利用的程度[26]。

2.1.2　培養液pH值的變化

乳酸桿菌富集培養后接種于含有消化后的香蕉抗性淀粉發酵培養基，厭氧培養 0、4、8、12、16、20 h 后發酵液的pH值變化情況如圖2。

圖2　乳酸桿菌發酵液的pH值變化Fig.2　Changes in pH of lactobacillus fermentation

由圖2可知，乳酸桿菌在發酵過程中發酵液的pH值隨培養時間的延長而降低，從0 h的7.2下降到20 h后的4.8?？梢娙樗釛U菌能很好地利用香蕉抗性淀粉產酸，維持腸道的酸性環境。

2.2　乳酸桿菌對香蕉抗性淀粉的發酵特性分析

胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉經乳酸桿菌分別發酵 4、8、12、16、20 h 后，發酵液中各種短鏈脂肪酸含量和總酸含量的變化情況如圖3和圖4。

圖3　乳酸桿菌發酵液中SCFA含量的變化Fig.3　Changes of SCFA content of lactobacillus fermentation fluid

圖4　乳酸桿菌發酵液中SCFA的總酸含量變化Fig.4　The total acid content of SCFA in lactobacillus fermentation fluid

由圖3可知，發酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量均隨著發酵時間的延長而增加。甲酸在發酵4 h后基本穩定在26 mmol/L左右；乙酸在發酵12 h時有明顯增加，12 h后增加速率減緩，20 h后達到29.23 mmol/L；丙酸含量在發酵過程中穩步提升，發酵20 h后可達到33.28mmol/L；丁酸含量在發酵4h時達到21.88mmol/L，之后緩慢增加，發酵20 h后達到25.41 mmol/L；發酵液中短鏈脂肪酸的總酸含量隨著發酵時間的延長均有所增加，且增長速率較為一致。發酵20 h后，總酸含量達到113.46 mmol/L?？傮w來看，乳酸桿菌能夠發酵香蕉抗性淀粉產生短鏈脂肪酸，但產酸能力略低于雙歧桿菌[27]。且隨著發酵時間的延長，乙酸和丙酸的產量增長較明顯，這與相關文獻的報道結果基本一致[28-29]。

短鏈脂肪酸的種類和數量主要受發酵底物的種類、數量、降解速率以及腸道菌群及宿主生理狀態等因素的影響。不同酵解底物產生的短鏈脂肪酸總量和比例不同，對腸道生理功效也不相同。在機體內大部分乙酸被吸收入血液，進入肝臟的代謝，作為周邊組織的能源，是機體從小腸不能吸收的碳水化合物中獲取能量的主要途徑。丙酸經結腸吸收后主要由肝臟代謝用作能源，并且能夠抑制膽固醇的合成。

2.3　發酵過程中產生的乳酸含量變化

經胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉經乳酸桿菌分別發酵 4、8、12、16、20 h 后，發酵液中乳酸含量變化情況如圖5。

圖5　乳酸桿菌發酵液中乳酸含量的變化Fig.5　The change of lactobacillus lactic acid content in the fermented liquid

發酵過程中乳酸含量隨著發酵時間的延長而緩慢增加，增長速率基本本不變。發酵20 h后，乳酸含量達到4.53 mmol/L。說明乳酸桿菌在發酵香蕉抗性淀粉時產生乳酸，但產量均在5 mmol/L以下，產乳酸的能力明顯低于雙歧桿菌[27]。乳酸產量是反映乳酸桿菌生理活性的重要指標，有研究發現乳酸可能是直腸菌群發酵利用香蕉淀粉產生的中間代謝物，能為腸道其它菌群提供能源[30]。

2.4　消化途徑對發酵產物的影響

圖6為不同消化處理后香蕉抗性淀粉發酵產物（短鏈脂肪酸）的含量分析。

圖6　消化途徑對發酵產物的影響Fig.6　The effects of digestive pathways on fermentation products

由圖6可看出，4種樣品的發酵產物中總酸含量大小依次為：胃液和小腸液消化后＞小腸液消化后＞胃液消化后＞原淀粉。分別經胃液消化的香蕉淀粉和經小腸液消化的香蕉抗性淀粉總酸產量相差不大，而經胃液和小腸液消化的香蕉淀粉的總酸含量提高較為明顯，達到112.95 mmol/L。

3　結論

我國香蕉資源豐富，且青香蕉富含天然抗性淀粉和膳食纖維，是制備高附加值抗性淀粉產品的良好來源。本試驗結果表明，培養基中添加香蕉抗性淀粉后，乳酸桿菌的數量明顯增加，發酵20 h后，乳酸桿菌短鏈脂肪酸總酸含量達到113.46 mmol/L，乳酸含量達到4.53 mmol/L。說明香蕉抗性淀粉能夠促進對乳酸桿菌的生長繁殖；通過體外消化和發酵模擬的研究發現，胃液和小腸液消化均使香蕉抗性淀粉發酵產物（短鏈脂肪酸）的含量比原淀粉高，表明胃液和小腸液的消化提高了香蕉抗性淀粉在大腸中的發酵作用，消化后的香蕉抗性淀粉更有利于腸道微生物的利用；隨著發酵時間的延長，發酵產物中甲酸的含量變化不大，而乙酸、丙酸、丁酸、短鏈脂肪酸的總酸和乳酸含量均有提高。本文基于香蕉抗性淀粉的發酵特性，初步研究了香蕉抗性淀粉與乳酸桿菌的相互作用，但對香蕉抗性淀粉的酵解機理還有待進一步研究。而香蕉抗性淀粉如何通過發酵產生短鏈脂肪酸進一步發揮相應的生理功能也需進一步研究。

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