過氧化氫降解水不溶性條斑紫菜多糖

王靈昭，史辰娟，汪維喜，蘇琳，王紀豐，邱春江，舒留泉，姚興存

1 (淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室/海洋生命與水產學院, 江蘇 連云港, 222005) 2 (連云港西墅物產有限責任公司, 江蘇 連云港, 222042)

多糖降解產物具有增強免疫、抗腫瘤、降血糖、降血壓、增強機體免疫等生理作用[1]，尤其是其分子質量小這一優點能夠克服大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足[2]。干紫菜含25%～50%的蛋白質(藻膽蛋白占紫菜干重的4%左右)，20%～40%的糖類[3-4]。因此，紫菜的高值化利用應重點關注藻膽蛋白和多糖。王靈昭等[5]提出了一種以鮮紫菜為原料，同時制備藻膽蛋白和多糖的新技術，但該技術體系產生大量水不溶性紫菜多糖。氧化劑的活性基團能奪取多糖β-1，4糖苷鍵1位或4位上的質子，使糖苷鍵發生非酶氧化斷裂而產生水溶性多糖，其中過氧化氫是常用的氧化劑[6]。因此，本文探究前述水不溶性紫菜多糖的過氧化氫降解，期望為高值化開發條斑紫菜過程中產生的水不溶性多糖的高值化利用提供研究基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

條斑紫菜(Porphyrayezoensis)：由連云港西墅物產有限責任公司提供。試劑純度為分析級或更高級。

1.2　儀器與設備

PS100型平板式離心機，張家港市樂余潤捷機械廠；MTK 662型斬拌機，馬多(北京)機械制造有限公司；CMD2000/4高剪切研磨分散機，切可(上海)機械設備有限公司；MS1001L2K高壓均質機，意大利GEA Nliro Soavi公司；CR-22N流體離心機，日本日立儀器有限公司；多用途臺式高速冷凍離心機，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Agileng1200高效液液相色譜儀，安捷倫科技有有限公司；Alltech3300蒸發光散射檢測器，美國格瑞斯公司；Nexus-870傅立葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；769YP-15A壓片機，北京天創尚邦儀器有限公司；Lambda35紫外/可見分光光度計，美國Perkin Elmer公司。

1.3　實驗方法

1.3.1水不溶性條斑紫菜多糖的制備

參照王靈昭等[5]的前期研究，制備水不溶性條斑紫菜多糖的技術路線如圖1所示。

圖1　制備藻膽蛋白和多糖的技術路線Fig.1　Technical route for preparing phycobiliproteinsand polysaccharides

將采收的紫菜離心脫水后于-20 ℃下凍藏備用。將凍藏紫菜斬拌，加入pH 8.0的KH2PO4-NaOH緩沖液(緩沖液與紫菜質量比為1∶1)于40 ℃下溶脹9 h，用高剪切研磨分散機超微粉碎后加水稀釋(物料與水質量比為1∶1)，然后于80 MPa下高壓均質。將均質后的物料用流體離心機離心，獲得的沉淀物即為水不溶性紫菜多糖，用于過氧化氫降解研究。

1.3.2過氧化氫降解紫菜多糖的影響因素研究

1.3.2.1過氧化氫濃度對多糖降解的影響

加水分散水不溶性紫菜多糖，使其干物質含量至2%，然后加入體積分數30%的雙氧水使體系的過氧化氫質量分數分別達到1.2%、1.5%、1.8%、2.1%和2.4%。密閉反應容器使體系在60 ℃下反應6 h，冷卻至室溫，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

1.3.2.2溫度對多糖降解的影響

加水分散水不溶性紫菜多糖，使其干物質含量至2%，然后加入30%的雙氧水使體系的過氧化氫質量分數達到1.8%。體系分別在40、50、60、70和80 ℃下反應6 h，冷卻至室溫，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

1.3.2.3時間對多糖降解的影響

加水分散水不溶性紫菜多糖，使其干物質含量至2%，然后加入30%的雙氧水使體系的過氧化氫質量分數達到1.8%。體系在60 ℃下分別反應4、5、6、7和8 h，冷卻至室溫，離心得上清液，分析上清液中的總糖含量。

以溶出率為指標衡量水不溶性紫菜多糖的過氧化氫降解，其定義為上清液中總糖含量占所消耗的水不溶性紫菜多糖中干物質含量的百分比。

1.3.3產物中低聚糖組分分析

將上清液樣品真空旋轉蒸發至原體積的1/5，用4倍體積的體積分數95%乙醇醇沉12 h，離心處理去除上清液。添加少量丙酮搖勻后重復上述操作，再加無水乙醇重復上述操作。然后，樣品置通風櫥中通風30 min，于45～55 ℃下干燥后將粉狀樣品置于干燥器中備用。

稱取0.5～2 g粉狀樣品(精確至0.000 1 g)，加入超純水至15 mL后充分混勻，然后加入等體積的質量分數1.5%磺基水楊酸以沉淀蛋白，混勻后靜置、離心，上清液經0.45 μm微孔膜過濾后用于粉狀樣品中的單糖及低聚糖分析。參考張媛媛等[7]的研究，采用高效液相色譜-蒸發光散射法分析粉狀樣品中的單糖及低聚糖。取葡萄糖、麥芽糖和乳糖作為對照品，色譜條件做如下修改：ZORBAX NH2色譜柱，柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相為V(乙腈)∶V(水)=70∶30，流速1 mL/min； 蒸發光散射器參數：漂移管溫度80 ℃，N2流速2.0 L/min。

1.3.4產物的紅外光譜分析

1.3.3中所述的粉狀樣品的紅外光譜分析采用KBr壓片法，將薄片進行4 000～400 cm-1范圍的掃描。

1.3.5產物的紫外光譜、蛋白質含量及總糖含量分析

將1.3.3中所述的粉狀樣品配成0.05 g/L樣液，然后進行200～400 nm的紫外掃描儀掃描。采用Bradford法測定粉狀樣品的蛋白質含量，并分析其總糖含量。

1.3.6化學及統計分析

2　結果與討論

2.1　過氧化氫降解紫菜多糖的影響因素研究

2.2.1過氧化氫體積分數對多糖降解的影響

由圖2可知，過氧化氫質量分數1.8%時溶出率顯著地(p<0.05)高于其他濃度下的溶出率。隨著過氧化氫質量分數的增加，溶出率在1.8%時增至最大而后減小，這種過氧化氫質量分數對多糖溶出的影響趨勢與PIERCE等的報道類似。不同糖單體及其構成的糖苷鍵對過氧化氫處理的敏感性不同，過氧化氫質量分數的增加會導致化學強度高的糖苷鍵斷裂，但也會引起敏感單體的降解，因此過氧化氫降解多糖時存在最適的過過氧化氫質量分數[6]。圖2表明，最適的為1.8%。

圖2　過氧化氫質量分數對多糖降解的影響Fig.2　Effect of hydrogen peroxide concentration onpolysaccharide degradation注：標有不同字母的指標值具有顯著性差異(p<0.05)。圖3、圖4同。

2.2.2溫度對多糖降解的影響

由圖3可知，不超過60 ℃時，溶出率隨著溫度的增加而顯著增加(p<0.05)；70 ℃的溶出率與60、80 ℃的溶出率比較，分別呈不顯著增加(p>0.05)和顯著增加(p<0.05)。過氧化氫作用下的溫度過高會導致多糖過度降解，產生非糖類產物，通過降低總糖測定值而降低溶出率。綜合考慮，最適溫度為60 ℃。不同多糖過氧化氫降解的最適溫度不同，本研究的最適溫度與WU等[8]報道的凝膠多糖過氧化氫降解的最適溫度相同。

圖3　溫度對多糖降解的影響Fig.3　Effect of temperature on polysaccharide degradation

2.2.3時間對多糖降解的影響

由圖4可知，隨著時間的增加，溶出率先增加后降低，在6 h時達到最大值；6 h的溶出率顯著大于(p>0.05)其他時間下的溶出率。時間過長，降解液中產生一些非糖類化合物而降低溶出率。綜合考慮，最適時間為6 h。

圖4　時間對多糖降解的影響Fig.4　Effect of time on polysaccharide degradation

2.2　產物中低聚糖組分分析

如圖5所示，圖5-A、5-B和5-C分別是對照品(葡萄糖、麥芽糖)、對照品(乳糖)和降解物樣品的色譜圖。由圖5-A、圖5-B可知，葡萄糖、麥芽糖、乳糖的保留時間分別為10.597、12.874和13.773 min；由圖5-C可知，降解物樣品在13.857、16.883和18.028 min處出峰。本研究采用磺基水楊酸法對粉狀樣品進行了除蛋白預處理，因此圖5-C中的組分應是糖類物質。氨基柱已成功用于低分子質量糖分析，乙睛-水作為流動相時，出峰順序為單糖、雙糖和較高聚合度的低聚糖[7]。由圖5可知，產物中保留時間13.857 min的組分可能為雙糖衍生物，而保留時間16.883、18.028 min的2種低聚糖組分在聚合度上不低于3，有關結構信息需深入研究。王靈昭等[9]已報道紫菜多糖的酸水解，比較可知，紫菜多糖酸水解產物組分單一[9]，而過氧化氫降解產物組分多、分子質量大。

圖5　對照品(A和B)和降解物樣品(C)的高效液相色譜Fig.5　High performance liquid chromatography of controlsamples (A and B) and hydrolysate sample (B)

2.3　產物的紅外光譜分析

圖6　紅外光譜Fig.6　Infrared spectrum

2.4　產物的紫外光譜、蛋白質含量及總糖含量分析

由圖7可知，在260～280 nm有明顯吸收峰，說明樣品含有蛋白質。采用Bradford法測定樣品的蛋白質含量，結果表明粉狀樣品含有蛋白質(2.12±0.06)%。該結果驗證了紅外光譜1 657 cm-1處是肽鍵上酰胺羰基吸收峰，樣品含有蛋白質，且蛋白質含量低于紫菜多糖酸水解的樣品蛋白質含量(6.88±0.07)%[9]。此外，粉狀樣品含有總糖(93.66±0.51)%。

圖7　紫外光譜Fig.7　Ultraviolet spectrum

3　結論

研究了過氧化氫降解水不溶性紫菜多糖的影響因素，以及產物的低聚糖組成、紅外光譜、紫外光譜、蛋白質含量和總糖含量。結果表明，多糖降解的最適條件為：過氧化氫質量分數1.8%，溫度60 ℃，時間6.0 h。液相色譜分析表明產物包含3種低聚糖組分，可能為雙糖、雙糖衍生物或聚合度不低于3的低聚糖。紅外光譜分析表明產物主要是β-糖苷鍵連接的吡喃型低聚糖，具有硫酸基和3,6-內醚半乳糖結構。紫外光譜分析表明產物含有蛋白質，進一步分析表明產物含有蛋白質2.12%、總糖93.66%。研究結果對水不溶性條斑紫菜多糖的高值化利用具有重要指導價值。

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