固相微萃取結合氣-質聯用確定北京干黃醬中關鍵香氣成分

趙星賀，黃佳，劉玉平*

1(清華大學附屬中學朝陽學校，北京，100027) 2(北京工商大學 食品學院，北京，100048)

香氣是食品與調味品的重要感官指標，目前關于北京干黃醬的香氣研究的文獻報道較少。石華治等采用同時蒸餾萃取法 (simultaneous distillation and extraction，SDE)提取了天源醬園中揮發性成分，經過氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析，共鑒定出33種成分[1]；苗志偉等采用相同的方法提取與分析了5種干黃醬中的揮發性成分，鑒定出69種成分[3]；劉永國等采用水蒸氣蒸餾(steam distillation，SD)提取結合氣-質聯機分析了干黃醬中揮發性成分，從中共鑒定出38種成分[4]。采用SDE與SD提取揮發性成分時，樣品與水混合加熱，會生成某些新成分。由于固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)具有樣品用量少、操作簡便、使用成本低、快速、不用溶劑等優點[5]，近年來在提取醬類調味品中的揮發性成分中得到普遍使用[6-7]。目前關于干黃醬中香氣成分的報道主要是關于其中所含的揮發性成分，這些成分是否具有香氣活性，是否是干黃醬的關鍵香氣成分尚未進行確定。本文采用固相微萃取法提取北京產干黃醬中的揮發性成分，利用氣相色譜-質譜-嗅聞聯用儀(GC-MS-O)對其中的揮發性成分及香氣活性物質進行鑒定，利用香氣活性值確定其中的關鍵香成分，以期為生產企業改進生產工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

仙源牌干黃醬(原料：非轉基因大豆、水、小麥粉、食用鹽、食品添加劑-山梨酸鉀)，凈含量250 g，塑料袋包裝，北京通州釀造廠生產，生產日期2017年7月13日；C6～C30正構烷烴(色譜純)，美國Supelco公司；苯乙醇、麥芽酚、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、2,3-丁二酮、2-乙酰基呋喃、二甲基三硫和2-甲氧基苯酚(均為分析純)，北京百靈威科技有限公司；丙酸乙酯與辛醛(分析純)，北京華威銳科化工有限公司；苯乙醛和1-辛烯-3-酮(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；2-甲基丙酸乙酯(分析純)，adamas公司；丁酸乙酯(分析純)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；茴香腦(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；甲硫醇(質量濃度為2 000 μg/mL的甲苯溶液)，Accu Standard公司。

1.2　儀器與設備

7890B氣相色譜-5977A質譜聯用儀，美國安捷侖公司，，-sniffer3000嗅覺檢測器，德國Gerstel公司；2 cm長50 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS (灰色)萃取纖維、手動固相微萃取手柄，美國Supleco公司；DF-lO1S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責任有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1固相微萃取法提取干黃醬中的揮發性成分

在40 mL固相微萃取專用瓶中依次加入10 g干黃醬、15 mL飽和食鹽水和30 μL(質量濃度為56.872 5 μg/L)的內標2-辛醇，在45 ℃水浴中平衡20 min。將2 cm長的灰色萃取纖維在GC-MS的氣相色譜儀進樣口中在250 ℃下老化至無雜峰，將萃取纖維插入裝有干黃醬的固相微萃取專用瓶中，吸附40 min；拔出萃取纖維，插入氣相色譜儀進樣口中，在250 ℃下解吸附5 min。

1.3.2GC-MS分析條件

氣相色譜條件：使用DB-WAX(30.0 m×250 μm，0.25 μm)極性色譜柱；采用程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min 的速率升至80 ℃，之后以4 ℃/min 的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持5 min；載氣He，載氣流量1.0 mL/min。

共和縣處于藏區，人們的飲食習慣主要是面食、青稞炒面以及肉類為主，對于蔬菜的需求量不是太大。2017年，共和縣蔬菜產量分布如下：

質譜條件：電子電離(EI)源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描模式為Scan，掃描質量范圍33～350 u。

嗅覺檢測器條件：從色譜柱流出的餾分以1∶1的體積比分別進入嗅覺檢測器和質譜檢測器，傳輸線的溫度是250 ℃。嗅聞口溫度220 ℃。

1.3.3正構烷烴保留時間的確定及保留指數的計算

取0.2 μL C7～C30正構烷烴的正己烷溶液，在1.3.2的GC-MS條件下進行分析，得到C6～C30正構烷烴的保留時間，用于保留指數的計算。保留指數按公式(1)計算：

(1)

式中:tn為具有n個碳原子的正構烷烴的保留時間；t(n+1)為具有(n+1)個碳原子的正構烷烴的保留時間；ti為待測組分的保留時間, 且tn

1.4　定性定量分析

定性分析：揮發性成分的定性采用質譜、保留指數和標準品3種方法。

定量分析：采用2-辛醇為內標，進行半定量，香氣活性成分的含量(μg/kg)按公式(2)計算：

(2)

2　結果與分析

2.1　揮發性成分與香氣活性物質的鑒定

經過萃取纖維萃取得到的揮發性成分經GC-MS-O分析，得到的總離子流圖如圖1所示，通過計算保留指數、檢索NIST11L譜庫、采用標準品對有香氣活性的物質進行比對，具體鑒定結果見表1。

圖1　通過固相微萃取提取到的北京干黃醬中揮發性成分總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of volatile components inBeijing dry yellow soybean sauce obtained by SPME

從表1可以看出，共鑒定出53種成分，其中醇類7種，酸類6種，酯類9種，醛類10種，酮類8種，吡嗪類5種，含硫化合物4種，酚類2種，其他2種。在這些成分中有44種在質譜檢測器上有響應，有20種在嗅覺檢測器上能夠被嗅聞到；兩種檢測器都能檢測到的有11種。

從目前對醬的風味成分分析的文獻報道可以看到，它們基本上都是報道醬中的揮發性成分[1,3,4,6,8-9]，而關于其中的香氣活性成分(即通過嗅覺檢測器能夠嗅聞到的成分)的報道則很少[10-11]。從表1可知，揮發性成分的含量多少不是判別該成分是否是重要香氣成分的決定因素，鑒定出來的多數揮發性成分不是香氣活性物質；鑒定出來的香氣活性物質中有一半以上的成分在質譜檢測器上沒有響應，因此只根據GC-MS的結果判斷某一成分是否對香氣有貢獻是很片面的。如何對這些具有香氣活性而在質譜檢測器上沒有響應(在總離子流圖上沒有色譜峰)的成分進行定量，需要進行深入研究。

嗅聞干黃醬樣品時，能夠嗅聞到醬香、焦糖香、甜香、酸香、煙熏香、腌咸菜等，這些香氣屬性與鑒定出來的香氣活性物質是相關的，如3-甲硫基丙醛賦予了干黃醬醬香，它在水中的香氣閾值很低(0.43 μg/kg[12])，極易被嗅覺檢測到；麥芽酚與2-甲基丁醛賦予了干黃醬焦糖香;酸香是由乙酸與3-甲基丁酸賦予的;2-甲氧基苯酚賦予了干黃醬煙熏香;二甲基三硫賦予了腌咸菜的氣息。在樣品中鑒定出5種吡嗪類化合物，都沒有嗅聞到它們的香氣。由于在分析過程中為了鑒定每種成分采用氣相色譜將它們分開，可能由于每種成分的閾值較高且含量低，不能被嗅覺檢測到；而在實際樣品中它們混合在一起以后某種香氣屬性的閾值可能達到嗅覺的檢測范圍，對干黃醬的香氣具有一定貢獻。對于表1中鑒定出來的一類物質都沒有被嗅聞到它們的香氣的，在以后的研究中將采用添加實驗來進一步確定它們對干黃醬的香氣貢獻大小。

續表1

類型保留時間/min化合物名稱CAS號匹配度保留指數計算值文獻值定性方法含量μg/kg嗅聞到的香氣特征吡嗪類10.76甲基吡嗪109-08-09012491256MS,RI20.22-12.172,5-二甲基吡嗪123-32-09113081314MS,RI10.90-12.322,6-二甲基吡嗪108-50-98713151320MS,RI42.82-13.732-乙基-6-甲基吡嗪13925-03-68613721382MS,RI4.52-14.20三甲基吡嗪14667-55-19113911395MS,RI18.21-5種96.67含硫類2.56甲硫醇74-93-1679675RI,S,O臭蘿卜2.81二甲基硫醚75-18-394736746MS,RI44.82-6.75二甲基二硫624-92-09710571071MS,RI,S45.61-13.56二甲基三硫3658-80-89013651378MS,RI,S,O7.84腌咸菜4種98.27酚類23.172-甲氧基苯酚90-05-19618301823MS,RI,S,O91.84煙熏香25.56苯酚108-95-29419711973MS,RI12.27-2種104.11其他類9.31D-檸檬烯5989-27-5991186MS11.11-22.72茴香腦104-46-19318041815MS,RI4.87茴香2種15.98

注：表中MS表示質譜定性，RI表示保留指數定性(保留指數的文獻值來自http://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser.html)，S表示采用標準品進行定性，O表示通過比對與標準品的香氣定性；“-”表示沒有嗅聞到香氣。

鑒定出來的這些揮發性成分主要有以下5種生成途徑：一是通過微生物新陳代謝所產生。在制作干黃醬時，微生物代謝會產生一些揮發性成分(或者微生物釋放出一些能夠分解原料產生揮發性成分的酶)，如乳酸菌會代謝出乙酸[13]；二是通過不飽和脂肪酸的降解產生。制作干黃醬的原料大豆中含有油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸[14]，這些不飽和脂肪酸可以發生氧化降解生成己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-酮等[15]；三是氨基酸的降解。制作干黃醬的原料大豆和小麥粉中都含有氨基酸，氨基酸發生降解產生了揮發性成分，如3-甲基丁醛可由亮氨酸降解產生[11]，3-甲硫基丙醛和甲硫醇可由蛋氨酸降解產生[16]；四是通過美拉德反應產生。鑒定出來的吡嗪、吡咯、呋喃類化合物都可以通過美拉德反應產生[17-18]；五是通過原料揮發性成分之間的反應產生。有的微生物代謝會產生脂肪酶，脂肪酶催化醇與酸的反應，產生酯類揮發性成分；六是原料帶入。生產醬時會使用少量的辛香料，由此帶入一些揮發性成分，如鑒定出來的茴香腦和檸檬烯可能就是由此。

目前文獻報道的提取北京干黃醬中的揮發性成分所用的方法是SDE[1,3]與SD[4]，從SDE提取物中鑒定出來的揮發性成分中酯類最多(有22種，只有乙酸乙酯、十六酸甲酯和十六酸乙酯3種在SPME提取物中鑒定出來)，而未鑒定出脂肪醇類物質[3]，在鑒定出的酯類中有一半以上為高級脂肪酸的低級醇酯，這與采用SDE提取揮發性成分時加熱有關；加熱會有利于一些沸點相對較高的成分的提取，同時也會使一些成分變化(如醇與酸反應生成酯，醇氧化生成醛或酸)；在SPME提取物中鑒定出來的酯類主要是分子量較低的脂肪酸的乙酯。從SD提取物中鑒定出來的38種揮發性成分中醛類和酸各有10種[4]，在這20種成分中只有8種在SPME提取物也鑒定出來。在SPME的提取物中鑒定出來的甲硫醇、二甲基硫醚和二甲基三硫在SDE和SD中都沒有鑒定出來，甲硫醇、二甲基硫醚沸點較低，在SDE與SD提取過程中隨著溶劑的去除它們也被去除了；二甲基三硫不穩定，受熱容易脫硫生成二甲基二硫。

2.2　關鍵香氣成分的確定

通過采用GC-MS-O可以從眾多揮發性成分中篩選出香氣活性成分，為了確定關鍵香氣成分，需要計算香氣活性物質的香氣活性值(odor activity value, OAV)。香氣閾值是指香氣活性物質能夠被人的嗅覺所能嗅聞到的最低濃度；香氣活性值是指香氣活性物質的濃度與其香氣閾值的比值，只有那些OAV大于1的香氣活性物質才是關鍵香氣成分[19]。為了確定干黃醬中的關鍵香成分，計算了香氣活性物質的OAV，所得結果如表2所示。

表2　北京干黃醬中香氣活性物質的香氣活性值Table 2　Odor activity values of aroma-active compoundsin Beijing dry yellow soybean sauce

從表2所得結果可知，鑒定出來的香氣活性物質中多數為關鍵香氣成分，它們對干黃醬的特征香氣起到了重要作用，其中3-甲基丁醛具有最高的OAV(為2 642.4)，其次為二甲基三硫與2-甲氧基苯酚，它們的OAV分別為791.9和109.3。

2.3　非香氣活性成分的香氣活性值的計算

為了確定干黃醬中鑒定出來的非香氣活性物質中是否有OAV大于1的物質，計算了沒有嗅聞到香氣的揮發性成分的OAV，所得結果見表3。

從表3可知，33種未被嗅聞到香氣的揮發性成分中，有20種成分的閾值有文獻報道，經過計算只有3種成分的OAV大于1，這3種成分分別是二甲基硫醚、二甲基二硫醚和己醛；它們的OAV大于1，而沒有被嗅聞到香氣的主要原因有以下3點，一是文獻報道的閾值測定方法不同，所得結果有一定差別，如在文獻[22]中報道的己醛的閾值為4.1～22.8 μg/kg，而文獻[12]中報道的是2.4 μg/kg；二是揮發性香成分的閾值大小與其所在基質關系很大，為了便于比較在此選用的都是在水中的閾值，該閾值小于在實際食品基質中的閾值；三是揮發性成分通過氣相色譜進行分離時，有時會出現餾分共流出現象，如果共流出的香氣成分之間發生相互抑制[24]，香氣強度會減弱，不能被嗅聞到。這3種成分是否是干黃醬的關鍵香氣成分，尚需進一步研究。

表3　北京干黃醬中非香氣活性物質的香氣活性值Table 3　Odor activity values of non-aroma-activecompounds in Beijing dry yellow soybean sauce

注：“-”表中沒有查找到該成分的閾值。

3　結論

采用固相微萃取結合GC-MS-O，對北京干黃醬中的揮發性成分進行提取與分析，共鑒定出53種成分，其中醇類7種，酸類6種，酯類9種，醛類10種，酮類8種，吡嗪類5種，含硫化合物4種，酚類2種，其他2種。在鑒定出來的53種成分中具有香氣活性的物質有20種。經過計算，香氣活性物質的活性值確定出3-甲基丁醛、二甲基三硫、2-甲氧基苯酚、苯乙醛、丁酸乙酯、壬醛和3-甲基丁酸為干黃醬的關鍵香氣成分。

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