早卵泡期長方案血清LH低的患者添加r-LH的臨床結局分析

田莉峰，伍瓊芳，譚俊，蘇瓊，李游，許定飛

(江西省婦幼保健院輔助生殖中心，南昌　330006)

隨著輔助生殖技術的發展，臨床促排卵方案得以優化，個體化用藥越來越受到重視。對于兩細胞-兩性腺學說的深入研究發現，不同激素在卵母細胞發育成熟的不同階段發揮不同作用。黃體生成素(LH)可以促進雌激素合成、誘導卵泡發育與成熟、選擇主導卵泡，還能在月經中期恢復卵母細胞的減數分裂、誘發排卵。在輔助生殖技術中，使用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)進行垂體降調節臨床應用廣泛，可有效預防LH峰的提前出現，但由于患者對GnRH-a的反應存在個體差異，也可能引起垂體降調節后血清LH水平過度抑制狀態。

目前國內外關于添加LH的研究很多，主要集中在GnRH-a黃體期長方案和GnRH拮抗劑(GnRH-ant)方案[1-2]，以及高齡婦女中[3]。GnRH-a黃體期長方案和GnRH-ant方案中添加LH的研究結果顯示：在降調節后，患者內源性LH會受到過度抑制，并且E2合成受到影響，而添加LH可以減少顆粒細胞凋亡，改善卵母細胞質量、胚胎質量，增加卵母細胞成熟度[1-2]。但目前關于GnRH-a早卵泡期長方案中添加LH的相關研究較少。我中心多年的臨床數據顯示，早卵泡期長方案與黃體期長方案和拮抗劑方案比較，有提高種植率和臨床妊娠率的優勢[4-7]，因此該方案在我中心廣泛使用。因為GnRH-a早卵泡期長方案中的全量GnRH-a有充分的降調節作用，促排卵過程中血清LH值比黃體期長方案和拮抗劑方案中LH值均明顯降低，過低的LH可能影響卵母細胞成熟度，所以，理論上補充LH可以增加成熟卵母細胞數量，改善卵母細胞質量、胚胎質量，提高胚胎種植率及臨床妊娠率等。為了進一步優化早卵泡期長方案，本研究回顧性分析早卵泡期長方案促排卵過程中對于血清LH值低的患者給予r-LH處理，探討添加r-LH是否改善患者的臨床結局。

資料與方法

一、研究對象及分組

收集2013年1月至2015年12月在本生殖中心行IVF/ICSI-ET，采用早卵泡期長方案的不孕患者為研究對象(共1 331個周期)。納入標準：(1)不孕年限>1年；(2)年齡20～45歲；(3)基礎FSH<12 U/L；(4)促排卵后第8天(D8)血清LH水平≤0.5 U/L。排除標準：(1)存在子宮畸形，如雙子宮、雙角子宮、單角子宮、子宮縱膈等，合并宮腔粘連、子宮腺肌癥、子宮肌瘤[粘膜下肌瘤或子宮肌層肌瘤但直徑>4 cm和(或)壓迫子宮內膜]；(2)夫婦雙方任意一方染色體異常；(3)曾有3次及以上復發性流產病史(包括生化妊娠流產)等；(4)合并存在其他輔助生殖禁忌癥的患者：如未控制的糖尿病、肝腎功能異常、未控制的高血壓、心臟病等，有腦血管意外或深靜脈血栓史，合并生殖系統癌癥或相關病史，存在未明確診斷的陰道流血等。

按照治療時是否添加重組人黃體生成素(r-LH)將患者分為觀察組和對照組。觀察組(689個周期)：D8開始添加r-LH至HCG日；對照組(642個周期)則不添加r-LH。

二、研究方法

早卵泡期長方案：患者于月經第2天肌肉注射長效GnRH-a(醋酸曲普瑞林，達菲林，3.75 mg/支，博福-益普生，法國)3.75 mg進行垂體降調節，28～30 d后行B超及內分泌激素檢查，達到垂體完全降調節標準(子宮內膜厚度≤5 mm，血清FSH<5 U/L，黃體生成素LH<5 U/L，E2<183 pmol/L)后，每天給予75～225 U重組人卵泡刺激素(r-FSH，果納芬，75 U/支或450 U/支，默克雪蘭諾，德國)啟動促排卵周期。并根據患者年齡、體重及卵巢反應情況調整劑量。

觀察組(果納芬+樂芮組)患者D8開始每天添加r-LH(樂芮，75 U/支，默克雪蘭諾，德國)1支，至HCG注射日。對照組(果納芬組)患者則不添加r-LH，繼續r-FSH促排卵，直至HCG注射日。

給予Gn 5 d后行陰式B超檢查監測卵泡發育大小，同時監測血清LH、E2及孕酮(P)水平，根據卵泡生長發育的速度調整Gn具體用量，直至 HCG 注射日。當至少有1個卵泡直徑≥19 mm或2個卵泡直徑≥18 mm時于當晚給予HCG(艾澤，250 μg/支，默克雪蘭諾，德國)250 μg皮下注射，36 h后在陰道B超引導下取卵。取卵當日給予黃體酮針劑(黃體酮注射液，20 mg/支，浙江仙琚)60 mg/d進行黃體支持。卵母細胞在體外培養3～6 h后進行常規IVF或ICSI，于受精后第3天或第5～6天，選擇最優質的胚胎1～2枚在腹部B超引導下進行移植。

優質胚胎：D3細胞數7～9個的Ⅰ、Ⅱ級胚胎；優質囊胚：D5～6囊胚分級≥3級，且其內細胞團為A或B級。

對獲卵數≥20個或移植前卵巢直徑≥7 cm者，考慮移植后有中重度卵巢過度刺激綜合征(OHSS)發生的可能，這類患者行全胚冷凍。移植后改用黃體酮陰道緩釋凝膠8%(雪諾酮90 mg/支，默克雪蘭諾，德國)1支/d，及地屈孕酮片(達芙通10 mg/片，蘇威制藥，荷蘭)早晚各1片行黃體支持。移植后13 d驗尿HCG或查血HCG確定是否生化妊娠，移植后1個月行B超檢查見胚芽及胎心搏動者診斷為臨床妊娠，并同時確定孕囊數。黃體支持從取卵日開始維持至孕10周。隨訪孕期及分娩時母嬰情況等。

三、觀察指標

主要觀察指標為抱嬰率、臨床妊娠率及胚胎種植率；次要觀察指標為Gn天數、Gn總量及獲卵數、注射HCG日LH、E2和P水平、HCG日內膜厚度、MⅡ卵率、雙原核(2PN)受精率、2PN卵裂率、優質胚胎率、早期流產率、全胚冷凍率、OHSS發生率，以及產婦分娩孕周、新生兒出生體重等。

四、統計學處理

結　　果

一、兩組患者基本情況比較

兩組基本情況比較，年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、基礎竇卵泡數(AFC)、基礎性激素水平等均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者促排卵情況比較

兩組患者降調節后血FSH、LH、E2水平，HCG日LH水平、HCG日內膜厚度，Gn天數、Gn總量比較均無統計學差異(P>0.05)。觀察組患者HCG日P水平、E2水平均顯著低于對照組(P<0.01)(表2)。

表1　兩組患者基本情況比較(-±s)

表2　兩組患者促排卵情況比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

三、兩組患者臨床結局比較

觀察組的獲卵數、每周期平均冷凍胚胎數及全胚冷凍率均顯著低于對照組(P<0.01)。觀察組的MⅡ卵率、種植率、臨床妊娠率、每周期抱嬰率均略高于對照組，但是無顯著性差異(P>0.05)。

表3　兩組患者臨床結局的比較 [(-±s)，%]

注：與對照組比較，*P<0.05；a種植率、臨床妊娠率和抱嬰率均按每移植周期計算

討　　論

基于兩細胞-兩性腺學說，LH和FSH在卵泡的生長發育中起著關鍵及相互協同的作用，卵泡膜細胞和顆粒細胞產生卵巢類固醇激素[8-9]。FSH在卵泡生長發育早期是必不可少的，并且通過芳香化酶將雄激素轉化為雌激素，而雄激素的產生是卵泡膜細胞在LH和FSH共同作用下將膽固醇轉化為雄激素[10]。雖然在沒有LH的情況下，FSH也可以誘導卵泡生長，但是在注射了HCG后，卵泡仍然可能出現生長發育缺陷，說明LH在卵泡發育過程中不僅是為芳香化酶提供雄激素底物，而且直接刺激和調節卵泡形成。值得注意的是，卵泡膜細胞和顆粒細胞產生大量的孕激素可以在LH的影響下轉化成雄激素。因此，LH的補充可以引起血清P水平降低。眾所周知，過高的P對內膜有不利的影響，導致內膜和胚胎的非同步發育，降低種植率。本研究結果與此一致，觀察組HCG日P水平低于對照組，較低的孕激素可能有利于內膜容受性，使觀察組臨床妊娠率有高于對照組的趨勢，雖然無統計學差異。LH在卵泡發育成熟過程中起著必不可少的作用，當卵泡發育至對FSH有反應的階段，顆粒細胞逐漸表達LH受體，開始接受LH的刺激，LH作用在卵泡膜細胞和顆粒細胞上，發揮FSH的大部分生物活性，包括對芳香化酶系統的刺激。因而，此時受FSH刺激的卵泡內顆粒細胞對FSH和LH可以產生類似的反應，尤其在FSH和LH非飽和劑量的狀態下，二者協同作用，反應疊加[11]。另外，公認為卵泡成熟通過顆粒細胞上逐漸表達的LH受體而減少了對FSH的依賴。提示LH可能在卵母細胞的成熟過程中起著關鍵性決定作用。但是，發育的卵泡暴露在不合適的高濃度LH中可能會干擾卵泡和卵母細胞的成熟，從而對生殖過程帶來副作用。GnRH-a降調節藥物的使用，能有效抑制促排卵過程中LH峰的提前出現，卻增加了LH的過度抑制。因此，促排卵過程中是否應該添加LH，以及添加LH的時機和劑量等成為目前輔助生殖領域學者討論的熱點問題之一。

卵泡發育和成熟需要最低閾值水平的LH，1%的LH受體被利用就足以維持類固醇的合成，但是如果LH低于閾值，則影響卵泡生長和卵母細胞成熟，減少雄激素和雌激素的合成[12]。Gordon等[13]研究認為，降調節后較低的內源性LH對于卵巢的正常反應和E2合成是充足的，但添加外源性LH可以增加胚胎著床率。LH超過發育卵泡的峰值可以終止卵泡發育：LH高于峰值，會抑制顆粒細胞增殖，導致卵泡閉鎖、黃素化。增加LH劑量，使LH高于峰值可減少小卵泡數[12]。在本研究中，觀察組添加外源性LH后，獲卵數減少，導致HCG日雌激素水平較對照組低，降低了OHSS風險，可使觀察組患者鮮胚移植概率增高，而觀察組因預防OHSS進行全胚冷凍的患者減少，全胚冷凍率降低。觀察組在獲卵數下降、移植率增高的情況下，每周期冷凍胚胎數目較對照組顯著降低。有研究表明，在內源性LH被抑制的IVF周期中，要想獲得理想的卵泡發育，血清LH值最好維持在1.2～5.0 U/L之間[14]。

目前國內外對于添加r-LH是否獲益，及獲卵數、妊娠率等結局指標仍存在爭議。這可能和研究設計針對了不同卵巢儲備、不同年齡的患者及采用不同的促排卵方案有關。Razi等[15]的一項隨機對照試驗顯示，對于年輕的卵巢功能正常的不孕患者，使用黃體期長方案，添加r-LH對妊娠結局沒有改善。Oliveira等[16]進行Meta分析發現，在GnRH-a長方案降調節周期中，促排卵早期(刺激第6天)開始添加r-LH會縮短刺激天數，減少Gn用量，增加HCG日雌激素水平；然而，獲卵數、成熟卵數、每取卵周期臨床妊娠率、著床率以及流產率無顯著性差異。Santi等[17]的另一項Meta分析數據顯示，IVF/ICSI-ET助孕治療中，FSH+LH治療組有更少的卵母細胞數和更高的妊娠率，MⅡ卵數各組間無統計學差異。添加r-LH或LH活性物質可以減少卵泡募集，但可以提高卵母細胞質量，從而提高妊娠率。李元等[18]對多囊卵巢綜合征患者在改良超長方案中添加LH的研究結果顯示：促排卵第8天血清LH<0.5 U/L的多囊卵巢綜合征患者添加r-LH后，平均獲卵數明顯下降，著床率、妊娠率、抱嬰率等有增高趨勢。本研究結果表明，觀察組獲卵數下降，但臨床妊娠率有提高的趨勢，與Santi等[17]及李元等[18]的研究結果一致。Ruvolo等[19]對長方案GnRH-a降調節的研究顯示，通過對取卵獲得的卵丘細胞進行凋亡檢測，刺激第8天起添加r-LH組比單純使用r-FSH促排卵組成熟卵母細胞增多，而且單用r-FSH組顆粒細胞凋亡率比添加r-LH組高。添加了r-LH的卵丘細胞在排卵前可以更好地支持胞核和胞漿成熟。Bosco等[20]證實人類卵母細胞凋亡決定了ICSI后的受精失敗。如果卵母細胞的凋亡通過卵丘細胞的縫隙連接分子信號通路調節激活，卵丘細胞的低凋亡率將會預示優質的卵母細胞質量，以及更好的受精率和優質胚胎率。Westergaard等[21]研究發現如果卵巢刺激第8天血清LH≤0.5 U/L，則流產率明顯增加(分別是45%和9%)。Fleming等[22]研究發現，若卵泡中期LH≤0.5 U/L，會出現HCG日E2水平降低，導致妊娠結局不良。李頌軍等[23]在一項改良超長方案中添加r-LH的研究中發現，使用改良超長方案降調節后，對于LH抑制較深者早期添加r-LH可獲得滿意的臨床結局，種植率及臨床妊娠率均顯著提高。目前認為衡量垂體-卵巢軸降調節過度的標準為卵泡中期血清LH水平≤0.5 U/L。由此，在本研究中，對早卵泡期長方案患者在卵巢刺激第8天進行LH水平測定。觀察組中r-LH的及時添加，改善了卵母細胞質量，MⅡ卵率增加，妊娠率相對較高，但未表現出統計學差異，可能和樣本量較小及添加r-LH的劑量不足或者添加時間較短有關。

綜上，臨床控制性卵巢刺激藥物各種各樣，不同的藥物會使不同的患者獲益。對于早卵泡期長方案的卵巢刺激過程中LH水平過度抑制(LH≤0.5 U/L)的患者，添加r-LH可能有利于改善IVF/ICSI-ET妊娠結局，FSH+r-LH促排卵方案有提高臨床妊娠率的趨勢。后續需要開展更大樣本量的前瞻性研究以進一步探討其對臨床妊娠結局的影響，并探索其個體化用藥的時間和劑量等。

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