維生素D對復發性流產患者外周血自然殺傷細胞的調節作用

徐士儒，王云霞，連若純，張諝，陳偉洪，何來賓，陳婉如，陳現*

(1.深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳　518045；2.深圳市福田區婦幼保健院婦產科，深圳　518045)

復發性流產(recurrent miscarriage，RM)是指孕20周前連續發生3次或3次以上的自然流產，在育齡婦女中發病率為1%～3%[1]。研究表明，引起RM的病因主要包括遺傳、內分泌和解剖結構異常、生殖道感染等，另外還有約40%～50%的患者病因不明[1]。免疫因素在RM的發生過程中可能起著重要的作用。正常妊娠的維持需要母體對胎兒產生免疫耐受，而免疫因素引起的RM可能是免疫耐受機制被破壞的結果。自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)在妊娠免疫機制中起著重要的調節作用，與RM中母胎免疫紊亂機制相關。周圍血CD3-CD56+NK細胞的比例及NK細胞毒性增加可能與RM患者的不良妊娠結局有關[2-3]。近年來研究發現維生素D對免疫系統有著重要的調節作用。特別是活性1，25(OH)2D，可抑制T淋巴細胞的增值和分化[4]，能夠促進Th1向Th2型免疫反應的轉變[5]，以及能夠抑制B細胞的增殖、漿細胞的分化和IgG抗體的分泌[6]。上述研究表明維生素D是一重要的免疫調節因子，維生素D缺乏可能參與了某些免疫因素介導的疾病發生。目前維生素D水平如何影響RM患者外周血NK細胞的數量和毒性尚不明確。本研究旨在探究RM患者血清中維生素D水平與外周血NK細胞數量和毒性的關系，以期為尋找RM的病因和臨床治療策略提供新的方向。

材料與方法

一、研究對象

選取2014年1月至2016年3月首次來本院治療的99例的不明原因復發性流產(unexplained recurrent miscarriage，uRM)患者為研究對象。所有患者均經過詳細詢問病史、全身及婦科檢查、染色體核型分析、宮腔感染和宮腔鏡以及內分泌等系統性檢查，入選標準為：(1)抗磷脂抗體(如抗β2糖蛋白1抗體、抗心磷脂抗體、抗磷脂酰絲氨酸抗體等)、抗核抗體(抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體等)和抗甲狀腺抗體檢測為陰性；(2)夫婦雙方染色體及胚胎染色體核型分析正常；(3)女方無生殖道感染和生殖道畸形；(4)內分泌激素水平正常；(5)未有藥物治療或維生素D補充史。所有患者均在黃體中期首次抽取外周血，并于當天分別檢測維生素D水平，NK細胞比例和NK細胞毒性。

根據內分泌協會臨床實踐指南，維生素D缺乏為25(OH)D水平<20 ng/ml，維生素D不足為25(OH)D在20～29.9 ng/ml之間，維生素D充足為25(OH)D≥30 ng/ml[7]。因此，本研究的99例RM患者根據其血清中25(OH)D水平被分為三組，即維生素D正常(vitamin D normal group，VDN)組35例、維生素D不足(vitamin D insufficiency group，VDI)組51例和維生素D缺乏(vitamin D deficiency group，VDD)組13例。維生素D不足和缺乏的患者每天口服0.5 μg的1，25(OH)2D(羅蓋全，上海羅氏制藥有限公司)，時長2個月。64例患者中，1例患者失訪，3例拒絕1，25(OH)2D治療，23例患者在維生素D補充過程中聯合了其它治療(如淋巴細胞治療)。僅有37例患者為單純1，25(OH)2D治療，其中有2例來自VDD組。考慮到VDD組的樣本過少，因此將維生素D不足和缺乏的患者混合為一組。1，25(OH)2D治療后，再次抽取患者黃體中期的周圍血，并檢測其NK細胞比例和細胞毒性。本研究入選患者均簽署檢測項目和治療知情同意書，實驗流程獲得醫院學術與倫理學委員會許可。

二、實驗設備和試劑

1.實驗設備：ARCHITECT PLUS isR 2000自動化檢測系統(Abbott，美國)，BD FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson，美國)。

2.主要實驗試劑：ARCHITECT 25-OH Vitamin D Reagent Kit(Abbott，美國)，BD Multitest 6-color TBNK Reagent Kit(Becton Dickinson，美國)，BD FACS裂解液(Becton Dickinson，美國)，K562細胞株(購自武漢大學保藏中心)，碘化丙啶(PI，Sigma，美國)，10-壬基溴代吖啶橙染料(DIO，Invitrogen，美國)，淋巴細胞分離液(Axis-Shield，挪威)，RPMI 1640培養基(Invitrogen，美國)，新生牛血清(杭州四季青公司，中國)。

三、方法

1.維生素D水平檢測：血清中25(OH)D水平的檢測采用化學發光微粒子免疫方法，所有步驟根據試劑盒說明書完成。

2.外周血NK細胞數量檢測：采用免疫熒光流式細胞技術檢測。逆向加樣法加入肝素抗凝血100 μl于Trucount管(Becton Dickinson，美國)中，再分別加入CD45-PerCP、CD3-FITC和CD16/CD56-PE抗體，室溫避光標記15 min，加入經10倍稀釋的BD FACS裂解液 2 ml，振勻，室溫避光10 min，樣本充分溶血后用PBS洗滌2次，流式細胞儀進行檢測，并用FACSDiva軟件進行數據獲取和分析，計數CD3-CD16+CD56+NK細胞的比例。

3.NK細胞毒性檢測[8]：抽取患者肝素抗凝血15 ml，用Ficoll密度梯度法分離人外周血單個核細胞(PBMCs)，充分洗滌后，用完全培養基調整細胞濃度為1 × 107/ml備用；同時收集對數生長期的K562細胞(NK細胞敏感的靶細胞)，加入PBS緩沖液10～20 ml重懸細胞，室溫離心，并進行細胞計數調整細胞濃度為1×106/ml；按細胞數1×106/ml加入3 mmol/L DIO染料，37℃孵育20 min；染色結束后，將K562細胞懸液用培養液洗滌2次；棄上清，通過細胞計數用完全培養基調整細胞濃度為2×105/ml備用；將處理好的PBMCs及K562細胞分別以50∶1、25∶1和12.5∶1的比例混合培養在96孔培養板中，每個比例設3個重復，每孔用培養液補足至200 μl；置于37℃，5% CO2培養箱混合培養4 h；4 h后，在混合培養孔中加入PI對死亡的K562細胞進行染色，流式細胞儀檢測，FACSDiva軟件進行數據分析。

四、統計學方法

所有統計分析均采用SPSS 16.0統計軟件進行。治療前各組NK細胞比例和NK細胞毒性采用單因素方差分析；治療前后NK細胞比例和NK細胞毒性變化采用配對t檢驗分析，以P<0.05為有統計學差異。

結　　果

一、RM患者一般資料及維生素D 水平

99例RM患者中，35例(35.4%)患者維生素D水平正常(≥30 ng/ml)，51例患者(51.5%)維生素D不足(20～29.9 ng/ml)，13例(13.1%)為患者維生素D缺乏(<20 ng/ml)。

RM患者的流產次數和維生素D水平在三組間具有顯著差異，而三組間的年齡、體重指數(BMI)無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1　RM患者的基線資料及維生素D水平(-±s)

注：與VDN組相比，*P<0.05；與VDI組相比，#P<0.05

二、外周血NK細胞數量和NK細胞毒性

外周血中CD3-CD56+NK細胞比例在三組間無明顯差異(P>0.05)。三組間的NK細胞毒性情況：與VDN組相比，效靶比(effector-to-target ratio，E∶T)為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細胞毒性在VDI中顯著增加(P<0.05)。而且，E∶T為25∶1和12.5∶1的情況下，NK細胞毒性在VDD和VDN兩組中有顯著差異(P<0.05)。然而，在E∶T為50∶1的情況下，VDI和VDD兩組的NK細胞毒性無顯著差異(P>0.05)(圖1，表2)。

A：三組CD3-CD56+ NK細胞的比例分析；B、C、D：三組效靶比為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細胞毒性，相互比較，*P<0.05圖1　RM患者外周血NK細胞數量和NK毒性的比較

三、1，25(OH)2D補充對外周血NK細胞數量和細胞毒性的影響

低維生素D水平的RM患者經維生素D治療后，CD3-CD56+NK細胞比例與治療前相比無顯著差異(P>0.05)。NK細胞毒性在三個E：T條件下均顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

A：治療前后CD3-CD56+ NK細胞的比例分析；B、C、D：治療前后效靶比為50∶1、25∶1和12.5∶1的NK細胞毒性，**P<0.01圖2　1，25(OH)2D對RM患者外周血NK細胞數量和NK毒性的影響

組別例數CD3-CD56+NK細胞(%)效靶比(E∶T)50∶125∶112 5∶1VDN3515 7±5 345 3±12 435 8±11 823 0±10 6VDI5117 1±7 051 6±8 8?43 2±9 1?30 2±10 3?VDD1316 4±7 152 3±12 1?45 4±11 9?#32 8±11 0?#

注：與VDN組相比，*P<0.05；與VDI組相比，#P<0.05

表3　1，25(OH)2D對RM患者外周血NK細胞數量和NK毒性的影響(n=37，-±s)

注：與治療前相比，*P<0.05

討　　論

生殖免疫學觀點認為，妊娠是一種成功的同種異體移植，認為RM的發生是同種異體移植失敗。成功妊娠依賴于母體對胎兒產生正確的識別和免疫耐受。NK細胞為異質性細胞群體，根據其表面CD56分子的表達水平主要分為CD56dimCD16+和CD56brightCD16-NK兩個細胞亞群，CD56dimCD16+NK細胞具有較強的殺傷功能，能夠誘導NK細胞的抗體依賴細胞毒性反應(ADCC)，對同種異體抗原具有殺傷作用，可在絨毛間隙中直接與絨毛接觸殺傷胚胎[9]。CD56brightCD16-NK細胞主要功能是分泌細胞因子如干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)-β等，殺傷功能較弱。由此可見，NK細胞在妊娠的建立和維持以及胎盤的發育過程中同樣發揮著重要作用。文獻報道，RM患者外周血中NK細胞比例和毒性均顯著增加[3]，認為NK細胞數量的增加是導致RM的一個重要因素[10]。與非妊娠女性比較，早期妊娠的女性其外周血中NK細胞活性顯著降低[3]。這些結果均表明NK細胞比例和毒性的降低可能能夠抑制母體對胎兒的同種免疫反應。

維生素D是維持人體生命所必需的營養物質，機體所需的大部分維生素D可在日光照射下由皮膚內的7-脫氫膽固醇轉變而來，同時也可以從富含維生素D的食物中獲得。由皮膚生成的和食物來源的維生素D在肝臟中經25羥基化酶的催化作用首先生成25(OH)D，血清25(OH)D是血液循環中維生素D的主要存在形式，常作為評價體內維生素D營養狀況的指標。隨后，25(OH)D在腎臟1a羥基化酶的作用下轉換為具有活性的1，25(OH)2D，從而促進腸道鈣離子的吸收以及骨代謝[7]。長期以來，人們對維生素D的認識主要集中在對骨代謝的調節。自1980年，人們發現維生素D受體在多種免疫細胞上表達后，越來越多的研究發現維生素D對免疫系統有著重要的調節作用，與多種疾病的發病機制密切相關[11-12]。

近年來越來越多證據表明維生素D缺乏或不足與婦產科妊娠并發癥有關[13]。本研究數據表明在RM患者中維生素D缺乏或不足的比例較高，維生素D缺乏或不足的RM患者外周血NK細胞毒性顯著增加。本研究結果與Ota等[14]報道一致，認為維生素D可參與調節RM患者的NK細胞毒性；他們還發現，維生素D對RM患者NK細胞數量也有顯著的調節作用。然而，本研究結果表明，與維生素D正常水平的RM患者比較，維生素D缺乏或不足的患者CD3-CD56+NK細胞的比例并沒有顯著變化。這些結果均表明維生素D可能對RM患者外周血NK細胞毒性起著重要的調節作用。因此，推測維生素D對NK細胞數量和細胞毒性的影響是相互獨立的。維生素D對NK細胞毒性的影響可能與穿孔素和顆粒酶的分泌有關，而與NK細胞數量無關[14]。由此可見，充足的維生素D水平在調控RM患者外周血NK細胞活性過程中可能發揮著關鍵作用。

本研究結果尚表明維生素D的補充對RM患者以上這些異常的細胞免疫反應具有一定的調節作用，RM患者經過1，25(OH)2D治療后，其外周血所有效靶比條件下的NK細胞毒性均顯著降低。本研究結果與早期的研究結果一致[6，15-17]。根據最近的文獻報道，維生素D能夠促進胞漿中去極化的穿孔素的表達，從而降調RM患者的NK細胞毒性[12]。但是，目前為止1，25(OH)2D對NK細胞的免疫調節機制仍不清楚。

綜上所述，在RM患者中維生素D缺乏或不足具有一定的免疫學意義。低水平RM患者其外周血NK細胞毒性可能異常增加，而補充1，25(OH)2D后可顯著降調NK細胞毒性。因此，對具有NK細胞毒性異常增加的RM患者，補充維生素D可作為一種新的輔助治療方案。

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