全外顯子組測序發現一家族性擴張型心肌病致病基因

周年偉　秦勝梅　劉　陽　趙維鵬 　崔　潔 潘翠珍　陳瑞珍　王小林　舒先紅

(1上海市影像醫學研究所　上海　200032; 2復旦大學附屬中山醫院心超室,3心內科,4介入治療科　上海　200032; 5上海市心血管病研究所　上海　200032)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy ,DCM)主要臨床特征是左心室擴大,并伴有左心室收縮功能受損,DCM患者中30%～50%為家族性[1]。目前已確定有40多種基因與家族性DCM發病相關[2]。隨著高通量測序技術的進步,全外顯子組測序通過外顯子捕獲技術富集全基因組DNA編碼序列,借助二代測序技術進行高效測序分析,全面提供全基因組外顯子區域的序列信息,極大促進了遺傳性疾病的基因診斷[3]。相較于常規基因panel篩查的方法,全基因組外顯子測序大大增強了檢測結果的可靠性。故本研究應用二代測序技術對一DCM家系行全基因組外顯子測序分析尋找其致病基因。

資 料 和 方 法

研究對象本研究對象為一安徽籍DCM家系(圖1)。先證者是一位43歲男性患者(Ⅲ-7,圖1),反復心悸、暈厥來復旦大學附屬中山醫院就診,初步診斷為心律失常,房室傳導阻滯。入院檢查心電圖提示房顫,三度房室傳導阻滯,左束支傳導阻滯;超聲心動圖提示左心房左心室增大伴左心室收縮功能減退,左心室射血分數LVEF=42%。該患者胸片提示心臟擴大(圖2);血清肌酸激酶和肌鈣蛋白T較正常值稍偏高,既往無高血壓、冠心病及糖尿病病史,該患者診斷為DCM,接受了相關藥物治療并植入了起搏器。先證者的表哥(Ⅲ-11,圖1),46歲,2年前被診斷為房顫,DCM,也接受了起搏器植入術。

一般臨床資料收集該家系所有成員詳細的臨床資料,包括體格檢查、發病年齡、初發癥狀、血清肌酸激酶、紐約心功能分級、常規心電圖及超聲心動圖,并根據需要行動態心電圖檢查。所有研究對象簽署知情同意書后,采集其外周血標本,按照試劑盒說明書步驟提取基因組DNA。本研究獲復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準(2016-16B),所有研究對象都知情同意并簽署知情同意書。

Filled symbols:Patients;Open symbols:Unaffected subjects;Small squares within symbols:Genotype(+)-phenotype (-);Diagonal lines:Death;Arrow:Probands.The presence (+) or absence (-) of the mutation is indicated for the genetically tested family members.

圖1擴張型心肌病家系圖
Fig1Familydiagramofdilatedcardiomyopathy

A:The electrocardiographic of patients(Ⅲ7) showed atrial fibrillation,complete atrioventricular block and left bundle-branch block.Echocardiogram (B) and chest X-ray (C)showed severe cardiomegaly (arrow).

圖2先證者的臨床檢查資料
Fig2Proband’scardiacexaminationinformation

全外顯子組測序本研究對該家系中5位成員(Ⅱ-2,Ⅲ-5,Ⅲ-7,Ⅲ-9 ,Ⅲ-11)的外周血DNA進行全外顯子測序實驗:樣品核酸提取,超聲打斷,TruSeq DNA Sample Preparation 試劑盒處理兩端連接測序接頭構建成文庫,使用 Roche Nimblegen SeqCap EZ v5.1 試劑盒捕獲全外顯子區域,采用 illumina XTEN 平臺進行高通量測序,數據質量 Q30 比例大于90%,外顯子目標區域測序深度中位值>50×,95%目標區域測序深度 >30×,外顯子丟失率<0.2%。

測序數據分析基因組測序原始數據經比對分析(bwamem/disco vardenovo/freebayes)取 SNV 及SV 數據;CNV數據使用EulerCNV 及 CNVnator 綜合判斷;SNV 數據經 in house cohort、 dbSNP138 及 1000G_OMNI2.5 注釋攜帶率,使用 snpEff及 in house 深度神經網絡分析流程注釋功能;剪切位點預測使用 in house C++/R 深度神經網絡模型;CNV/SV 數據經 in house cohort、1000G 及公開 CNV 數據庫數據過濾攜帶率,使用 Langya 注釋;信號轉導通路分析使用 in house R/Python/Perl package;OMIM/Monarch/ExAC 數據庫分析使用in house Perl/R API;表型基因型相關神經網絡分析使用Langya/Marshes。數據解讀參考美國醫學遺傳學和基因組學學院(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)相關指南;變異命名參照 HGVS 建議的規則給出(http://www.hgvs.org/mutnomen/)。

結　　　果

通過對家系患者和正常人全外顯子組測序,在數據庫中分析比對后發現LMNA基因6號外顯子上存在一個雜合無義突變:LMNA,chr1,156105716,c.961 C>T,p.Arg321Ter。既往研究表明LMNA基因突變會引起心電異常傳導,心肌收縮活動減弱,心功能出現異常表現。本研究中篩查的基因突變位點在漢族人群中尚屬首次報道。既往研究闡明此突變位點引起DCM的機制:無義突變導致LMNA編碼蛋白質過程提前終止,相應蛋白質功能不足,進而導致該家系中突變攜帶者出現心功能異常,因此我們認為LMNAc.961 C>T突變是該DCM家系的致病突變。

基因型與臨床表型的驗證:我們對參與研究的家系成員通過 Sanger 測序發現心功能臨床表現正常的成員(Ⅱ-2,Ⅲ-5,Ⅲ-9)不攜帶該突變位點,而心功能臨床表現異常的成員(Ⅲ-7,Ⅲ-11)攜帶LMNA雜合突變位點,同時我們對自愿參加基因篩查的子代即Ⅳ-4(男,18歲)、Ⅳ-5(女,22歲)、Ⅳ-6(男,19歲)、Ⅳ-7(男,11歲)、Ⅳ-8(女,14歲)和Ⅳ-10(男,16歲)進行了驗證,發現Ⅳ-6、Ⅳ-10為雜合突變,攜帶此突變位點,符合遺傳學規律,由于他們年齡尚小,未到發病的高峰期,目前不能明確臨床表型(圖3)。

子代Sanger 驗證發現Ⅳ-6、Ⅳ-10為雜合突變,其中Ⅳ-6(男,19歲)自述偶爾胸悶氣短,心電圖、心臟超聲檢查及其他臨床指標提示心功能良好;24 h心電圖檢查顯示:Ⅰ度房室傳導阻滯,竇性停搏,全程大于2S停搏485個。Ⅳ-10(男,16歲)自述日常無不適,心電圖、心臟超聲檢查及其他臨床指標提示心功能良好;24 h心電圖檢查顯示:偶發房早,室早(多源),Ⅱ、Ⅲ、aVF、V4～V6:ST段自J點抬高>0.1 mv。

c.961 C>T variant on the LMNA gene in the family confirmed by Sanger sequencing.Affected individuals (Ⅲ-7,Ⅲ-11).

圖3家系成員突變變位點Sanger測序圖
Fig3Sangersequencingofthegenemutationinthefamilymembers

討　　　論

DCM是以左心室或雙心室擴大,心室收縮功能障礙、心室壁變薄為主要特點的一種原發性心肌病,是導致心源性猝死和心力衰竭的主要原因[4]。通過在患者家族中進行相關致病基因的研究發現,家族遺傳所占的比例較高。家族性DCM的臨床表型存在異質性,攜帶同一致病基因的家系不同成員之間的臨床表現不盡相同,這可能與年齡、性別、基因突變的部位、類型等因素有關[5]。根據以往研究報道統計,由于受限于檢測技術以及對DCM整體認識水平,家族性DCM相關致病基因及突變檢出率不到30%[6]。經典的Sanger測序法準確性高,但檢測序列的長度有限,效率較低,僅適用于篩選已知致病基因突變位點,很大程度上阻礙了DCM的致病基因檢測[7]。

隨著二代測序技術(next-generation sequencing,NGS)的出現,特別是與外顯子組捕獲技術相結合的NGS能快速準確地了解基因序列信息,極大地幫助我們了解遺傳性疾病,通過對家族相關基因的比對分析,能夠較準確地發現致病基因及突變[6]。本研究通過外顯子捕獲技術富集全基因組DNA編碼序列,同時提高了序列覆蓋率和熱點基因篩選效率,能夠較準確地找出相關致病基因。

本研究通過測序分析發現該家系的致病基因為LMNA,其6號外顯子Arg321ter是可能的致病性突變,此無義突變導致LMNA編碼蛋白質提前終止,進而引起心功能異常。LMNA為1號染色體,分別編碼Lamin A 和Lamin C 蛋白質。 這兩種蛋白質與LMNB基因編碼的Lamin B 蛋白質共同組成細胞的核纖層。核纖層緊貼于內層核膜的內表面,在維持核膜完整性、提供染色體錨著位點、調節細胞的分化及核周期性的解體和重組過程中發揮重要作用[8-9]。動物實驗研究發現敲除或者純合突變LMNA基因的小鼠出生2個月內都會死亡,而雜合突變小鼠的生存期與野生型的相似[10-12]。

LMNA基因的無義突變(c.Arg321ter)導致編碼蛋白質提前終止,相應編碼的蛋白質功能異常。既往研究證實LMNA基因與核纖層蛋白疾病相關,并且5%～8%的家族性DCM都與此突變有關[13-14]。經數據庫檢索此位點在漢族人群中尚屬首次報道,既往研究證實此突變會導致心功能異常,在已報道攜帶Arg321ter突變的患者均有類似與傳導系統疾病相關DCM的臨床表現,這與本研究家系中患者的表現相一致[15-16]。Arg321ter突變轉錄本可通過無意義密碼子介導的mRNA降解途徑來遏制截短突變蛋白質的表達,導致相應蛋白質量減少從而引起DCM[17]。此家系子代Sanger 驗證發現Ⅳ6、Ⅳ10為攜帶者,但兩者心電圖、心臟超聲及其他臨床指標都無明顯異常,均無明顯心功能異常表現,后加做24 h心電圖顯示有房室傳導阻滯、竇性停搏等心電活動異常,這主要是由于LMNA基因突變導致的心功能異常的早期表現是心電活動異常,它先于心臟收縮功能,同時這也是由LMNA突變導致的DCM患者容易發生惡性心律失常,甚至猝死的原因。因此,對于家系中的攜帶者,我們告知其本人及家屬存在的潛在風險,注重預防并定期隨訪,針對心功能出現的異常情況及時給予干預。

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