STAT3磷酸化與白塞病臨床活動性的關系

鮑華芳　蔡劍飛　陳　永　羅　丹　申　艷　鄒　峻　管劍龍

(復旦大學附屬華東醫院免疫風濕科　上?！?00040)

白塞病(Behcet’s disease,BD)是一種原因不明的,以血管炎為病理基礎的多系統損害性疾病[1]。臨床上以復發性口腔潰瘍、生殖器潰瘍、葡萄膜炎和結節性紅斑為主要特征,并可累及胃腸道、心血管、神經、血液等多系統。盡管世界各地均有BD報道,但BD在沿古絲綢之路的中東、地中海和遠東國家發病率更高,如中國、韓國、日本、土耳其和伊朗。其中,土耳其報告的發病率最高,為80～370/10 萬人[2-3]。

Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)(JAK/STAT 通路)對Th1、Th17細胞分化具有重要作用[4-7]。而T細胞免疫紊亂,特別是Th1和Th17活化和Treg調節減弱被認為是BD發病機制的基石[7-10]。近年研究提示,BD 人群存在STAT3、STAT4基因突變。Hu等[4]研究發現,與健康對照相比,BD患者STAT3的rs2293152基因型顯著增多。已有研究證明類風濕關節炎、炎癥性腸病、脊柱關節病和銀屑病等自身免疫病與JAK/STAT 通路相關[7,11]。少量研究提示JAK/STAT3 參與BD發病過程。Hamedi等[1]發現,負調節JAK/STAT信號通路的細胞因子信號轉導抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling,SOCS)在BD中表達上調。Tulunay等[7]通過通路富集分析發現,JAK/STAT3 通路在BD患者的CD14+單核細胞和CD4+淋巴細胞中激活。但目前缺乏有關STAT3磷酸化在BD發病機制中作用的報告。

本研究應用STAT3磷酸化特異性抑制劑Stattic,以活動期和緩解期BD患者為研究對象,探討STAT3磷酸化在BD發病機制中的作用及其與BD活動的關系,以期為BD治療尋找新靶點。

資 料 和 方 法

研究對象納入BD患者均符合2013國際白塞病診斷標準(the International Study Group for Behcet’s Disease),排除伴有其他疾病后入組。BD患者的下列癥狀≥3個則定義為BD活動期(BD -active,BD -A)患者:口腔潰瘍、生殖器潰瘍、針刺反應陽性、結節性紅斑、眼葡萄膜炎、關節炎以及心臟、腸道、血管、血液和神經系統累及。若BD患者癥狀<3個則定義為BD緩解期(BD -remission,BD -R)[1,7]。健康對照(healthy control,HC)為與患者無親屬關系的健康成人。BD患者和健康對照均于2016年3月至8月期間在復旦大學附屬華東醫院風濕科門診及病房募集。本研究通過復旦大學附屬華東醫院倫理委員會批準(批件編號 20140100),所有參與對象均已簽署知情同意書。

標本采集采集每位實驗對象全血樣本,統計匯總臨床資料包括病史、體征、實驗室和影像學檢查及治療經過。

細胞實驗

外周血單個核細胞的分離與培養無菌條件下抽取BD -A患者、BD -R患者和HC靜脈血15 mL (EDTA抗凝),混勻,2 h內處理。采用Ficoll密度梯度離心法提取PBMC。D -Hank’s液稀釋PBMC細胞,制成PBMC細胞懸液,并調整濃度至細胞2×106/mL。取PBMC懸液加入T25培養瓶內,每瓶3 mL。BD -A、BD -R和HC組內進一步均分為Stattic抑制劑亞組和空白對照(blank control)亞組。Stattic抑制劑亞組加入2.5 μmol/L Stattic[12]及1 640培養基共5 mL,空白對照亞組中僅加1 640培養基共5 mL。將PBMC細胞板放置于 37 ℃、5% CO2培養箱(日本Sanyo公司)培養72 h備用。

熒光定量聚合酶鏈反應(reverse transcription-PCR)提取總RNA;按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA;參照Genbank中人TNF-α、IFN-γ和IL-17基因序列設計合成,所用引物見表1。按逆轉錄M-MLV1試劑盒(TAKARA公司)說明書依次加入以下試劑建立20 μL PCR反應體系:10 μL Subgreen mix (2×),正、反義引物各0.5 μL,1 μL RT反應液,8 μL的DEPC dH2O。于Applied Biosystems 7900HT熒光定量PCR儀(加拿大Funglyn Biotech公司)上進行擴增反應,繪制擴增曲線,通過2-△△Ct計算目的基因表達水平。

表1　TNF-α、IFN-γ和IL-17實時PCR引物序列Tab 1　Sequence of TNF-α,IFN-γ and IL-17 primers used in RT-PCR

Western blot (WB)檢測提取適量PBMC標本總蛋白;將蛋白質樣品變性后以10% SDS-PAGE電泳分離,再將蛋白質條帶轉印至同相支持物上(PVDF膜),然后分別用一抗pSTAT3抗體、STAT3抗體及二抗羊抗兔IgG抗體(均為美國Abcam公司)孵育,采用UVP分析儀對膠片進行掃描,系統按預先設定參數,自動生成蛋白質條帶的灰度值。

流式細胞術(flow cytometry,FCM)檢測使用移液器輕輕吹勻培養后的PBMC,將細胞混合液移入15 mL離心管中,500×g離心10 min,離心結束后,棄培養液上清,重復上述離心過程1次。用500 μL PBS懸浮細胞沉淀,以4%PFA固定2 h之后分別加入pSTAT3抗體和STAT3抗體,室溫條件下孵育30 min,500×g離心5 min,PBS懸浮細胞進行流式細胞術分析(美國BD Biosciences公司FACS Calibur流式細胞儀)。

ELISA檢測細胞培養上清液-80 ℃保存,按照ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)要求和步驟檢測TNF-α、IFN-γ和IL-17蛋白質水平。

結　　　果

臨床資料共納入BD患者30例,健康對照10例。根據前述診斷標準,BD患者又分為BD -A和BD -R組。3組平均年齡(F=1.357,P=0.274)及性別(P=0.875)差異無統計學意義。BD -A組和BD -R組病程差異也無統計學意義(t=-1.294,P=0.212)。具體資料見表2。

ItemsBD-ABD-RMean(y)34.20±11.2040.10±11.78Male/Female(n)6/45/5Diseaseduration(y)6.53±6.0610.70±8.19Oralulcers9(90)4(40)Genitalulcers4(40)1(10)Ocularlesions2(20)2(20)Erythemanodosum6(60)5(50)Folliculitis3(30)2(20)Jointinvolvement2(20)1(10)Intestinalulceration2(20)0Cardiovascularinvolvement2(20)1(10)Centralnervoussystem2(20)1(10)Pathergytest01(10)

pSTAT3和STAT3蛋白質水平兩因素方差分析顯示,BD對pSTAT3蛋白質(FCM檢測:F=84.83,P<0.000 1;WB檢測:F=717.8,P<0.000 1)和STAT3蛋白質水平(FCM檢測:F=41.03,P<0.000 1;WB檢測:F=207.5,P<0.000 1)影響顯著,BD活動性增加,蛋白質水平增加;STAT3磷酸化對pSTAT3蛋白質(FCM檢測:F=41.84,P<0.000 1;WB檢測:F=573.7,P<0.000 1)和STAT3蛋白質水平(FCM檢測:F=16.55,P<0.000 1;WB檢測:F=8.823,P=0.004 4)影響差異顯著,磷酸化作用抑制時蛋白質水平減少。Bonferroni post hoc test事后檢驗結果顯示,BD -A組與BD -R組相比,BD -A組中空白對照亞組和Stattic抑制劑亞組pSTAT3蛋白質水平均高于BD-R組(FCM檢測:空白對照亞組,t=4.228,P<0.001;Stattic抑制亞組,t=3.668,P<0.01;WB檢測:空白對照亞組,t=6.922,P<0.001;Stattic抑制亞組:t=3.595,P<0.01);BD -A組中空白對照亞組STAT3蛋白質水平顯著高于BD -R組(FCM檢測:t=4.015,P<0.01;WB檢測:t=2.758,P<0.05),BD -A組中Stattic抑制亞組較BD -R組有上升趨勢(FCM檢測:t=1.783,P>0.05,BD -Rvs.BD -A,19.28±1.071vs.21.54±3.498;WB檢測:t=3.595,P<0.01,BD -Rvs. BD -A,0.447 3±0.008 6vs.0.455 3±0.019 8)(圖1和圖2)。

TNF-α、IFN-γ及IL-17mRNA和蛋白質水平BD和STAT3磷酸化對TNF-α、IFN-γ和IL-17 mRNA和蛋白質水平有顯著影響。BD活動性增加,TNF-α mRNA (F=20.60,P<0.000 1)和蛋白質(F=28.89,P<0.000 1)、IFN-γ mRNA (F=39.17,P<0.000 1)和蛋白質(F=5.437,P=0.023 6)、IL-17 mRNA(F=13.42,P=0.000 7)和蛋白質(F=16.93,P=0.000 2)水平顯著增加。STAT3磷酸化作用被抑制時,TNF-α mRNA(F=66.46,P<0.0001)和蛋白質(F=22.11,P<0.000 1)、IFN-γ mRNA (F=44.54,P<0.000 1)和蛋白質(F=17.40,P<0.000 1)、IL-17 mRNA(F=30.48,P<0.000 1)和蛋白質(F=15.50,P<0.000 1)水平顯著減少。Bonferroni post hoc test事后檢驗結果顯示:BD-A組中TNF-α mRNA水平在空白對照亞組(t=8.180,P<0.001)和Stattic抑制劑亞組(t=3.736,P<0.01)中均顯著高于BD -R組;BD -A組TNF-α蛋白質(t=2.644,P<0.05)和IFN-γ蛋白質(t=2.668,P<0.05)水平在空白對照亞組中顯著高于BD -R組,在Stattic抑制劑亞組差異無統計學意義;BD -A組的Stattic抑制劑亞組中,IFN-γ mRNA (t=4.289,P<0.001)、IL-17 mRNA(t=3.921,P<0.001)和IL-17蛋白質(t=3.004,P<0.01)水平表達較BD -R組顯著升高,而在空白對照亞組中差異無統計學意義(圖3)。

討　　　論

STAT3即信號轉導子及轉錄激活子通過JAK/STAT3 通路磷酸化,pSTAT3表達可作為STAT3通路激活的直接檢測指標[13]。酪氨酸激酶(janus activated kinase,JAK)可磷酸化細胞因子受體和多個含特定SH2結構域的信號分子。細胞因子與相應受體結合后引起受體分子二聚化,使與受體偶聯的JAK活化。JAK激活后催化受體上的酪氨酸殘基發生磷酸化修飾,進而使STAT3磷酸化。pSTAT3隨即二聚化并進入細胞核,與相關 DNA 結合,促進轉錄,并合成相關蛋白質[7,11,14]。

本文研究STAT3磷酸化特異性抑制劑Sattic對BD患者PBMC細胞STAT3、pSTAT3以及Th1、Th17相關細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17水平的影響。Stattic為卟啉類非肽小分子,是STAT3磷酸化的特異性[15-16],通過與STAT3的SH2功能區結合,抑制STAT3在Tyr705位點磷酸化,以抑制STAT3基因表達、蛋白質活化、二聚體形成而抑制STAT3核轉運。近來研究提示,STAT3磷酸化作用增強可能與BD免疫應答相關,Wang等[17]研究發現,與免疫應答相關的芳烴受體基因(aryl-hydrocarbon receptor,AhR)基因在BD-A患者PBMC中表達比BD-R患者和HC減低,同時STAT3和STAT5的磷酸化作用增強。本研究結果顯示,與HC比較,BD -A、BD -R組pSTAT3、STAT3蛋白質水平均升高;BD活動性增加,pSTAT3和STAT3蛋白質水平均增加;磷酸化作用被抑制時總體STAT3和pSTAT3蛋白質水平均減少;且BD -A患者的pSTAT3和STAT3蛋白質水平顯著高于BD -R組。研究結果說明,STAT3通路在BD中激活且與BD活動性相關。

A:pSTAT3 and STAT3 expression analyzed by flow cytometry;B:Relative protein expression of pSTAT3;C:Relative protein expression of STAT3.HC:Health control;BD -R:BD -remission;BD -A:BD -active.(1)P<0.01.

圖1pSTAT3和STAT3在3組的空白對照亞組和Stattic抑制劑亞組PBMC細胞內蛋白質水平流式細胞術檢測結果
Fig1pSTAT3andSTAT3proteinexpressionlevelsinPBMCoftheblankcontrolsubgroupandtheStatticsubgroupfromthethreegroupsbyflowcytometry

A:The protein bands of pSTAT3 and STAT3;B:Relative protein expression of pSTAT3;C:Relative protein expression of STAT3.HC:Health control; BD -R:BD -remission; BD -A:BD -active.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖2pSTAT3和STAT3在3組的空白對照亞組和Stattic抑制劑亞組PBMC細胞內蛋白質水平Westernblot檢測結果

Fig2pSTAT3andSTAT3proteinexpressionlevelsinPBMCoftheblankcontrolsubgroupandtheStatticsubgroupfromthethreegroupsbyWesternblot

JAK/STAT 通路對Th1和Th17細胞分化具有重要作用[4-7]。而既往研究提示Th1和Th17細胞在BD中表達均增強,并與BD疾病發生與活動性相關[7,9,18-20],且Th1和Th17相關細胞因子如IL-17、IL-23和TNF-a在BD發病機理中起關鍵作用[9,21-22]。Tulunay等[7]發現,STAT3信號通路在BD中的激活可能是通過上調Th1 / Th17相關細胞因子(如IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-23)的水平。IFN-γ是經典的Th1類細胞因子。Zhou等[9]研究表明,BD葡萄膜炎患者房水中的IFN-γ水平顯著高于白內障等疾病引起的葡萄膜炎患者。IL-17是Th17細胞最具代表性的細胞因子,在BD-A患者血清中顯著升高,可通過誘發T細胞黏附而導致炎癥反應和組織損傷[10]。TNF-a主要由Th1細胞和巨噬細胞產生,通過誘導促炎因子和黏附分子表達而導致局部炎癥,且TNF-a升高與BD活動性相關。近年來,TNF-α抑制劑已應用于難治性BD的臨床治療[22]。本研究中,BD-A和BD-R組TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白質和mRNA水平均高于HC;Stattic抑制劑則下調TNF-α、IFN-γ和IL-17水平。其中BD-A組TNF-α和IFN-γ水平在空白對照亞組顯著高于BD-R組,抑制STAT3磷酸化后與BD-R組相比差異無統計學意義;IL-17蛋白質則在空白對照亞組中差異無統計學意義,而Stattic抑制亞組中BD-A組顯著高于BD-R組。IFN-γ是經典的Th1類細胞因子,TNF-a主要由Th1細胞和巨噬細胞產生;IL-17是Th17細胞相關細胞因子。由此,STAT3通路激活時Th1細胞相關細胞因子在BD-A組中水平較BD-R組高;STAT3通路抑制后,Th17細胞相關細胞因子在BD-A組中水平高于BD-R組。本文結果提示,STAT3磷酸化可能對Th1和Th17細胞活化均有促進作用,且對Th1細胞活化影響較大。抑制STAT3磷酸化可降低BD患者Th1、Th17相關細胞因子水平,STAT3通路激活可能介導BD患者Th1、Th17活化且與BD活動性相關。由此推測,抑制BD患者STAT3磷酸化可延緩BD進程,改善患者癥狀。

抑制IL-6、JAK等上游信號通路、干擾STAT3二聚體形成、阻礙STAT3核內轉移、干擾STAT3對靶基因啟動子結合均能有效抑制STAT3的轉錄活性[23]。JAK3抑制劑托法替布(Tofacitinib)為STAT3信號通路的間接抑制劑[24],目前,托法替布已用于類風濕關節炎和炎癥性腸病的治療,并在2015年首次納入美國風濕協會類風濕關節炎治療指南[25]。推測以托法替布為代表的STAT3通路間接抑制劑可應用于BD治療。本研究提示,STAT3通路激活介導BD患者TH1、TH17活化且與BD活動性相關,STAT3磷酸化有望成為BD治療研究新靶點。

HC:Health control;BD -R:BD -remission;BD -A:BD -active.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖3TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白質和mRNA水平在3組的空白對照亞組和Stattic抑制劑亞組PBMC細胞內的表達
Fig3TNF-α,IFN-γandIL-17proteinandmRNArelativeexpressionlevelsinPBMCoftheblankcontrolsubgroupandtheStatticsubgroupfromthethreegroups

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