水通道蛋白3、8和9的異常亞細胞分布參與大鼠酒精性肝病的發病

李　靜　趙廣西　孫劍勇

(復旦大學附屬中山醫院消化內科　上?！?00032)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是由于長期大量飲酒而導致的肝臟急性或者慢性疾病。根據發病的輕重可將其分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化和酒精引起的肝癌。在2010年,由酒精性肝硬化導致的死亡人數占全球總死亡人數的0.9%[1]。

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一種跨細胞膜蛋白,廣泛分布于哺乳動物的各器官組織。目前發現哺乳動物有13種AQP表達,分別命名為AQP0～12。在亞細胞水平,AQP可以被檢測分布于細胞內囊泡(intracellular vesicles,IV)、細胞膜和核膜。AQP也分布于細胞外囊泡,如外泌體等,并且被認為具有作為診斷疾病的腫瘤標志物的潛在價值[2]。

AQP3、8和9廣泛分布于消化系統。AQP3屬于水-甘油AQP,大量分布于消化道上皮,可以使水、甘油和其他小分子物質通過細胞膜。最新研究表明AQP3與細胞增殖和遷移有關,并且參與維持腸道屏障完整性等生理病理過程[3]。AQP8、AQP9分布于包括肝臟、腸道在內的許多消化系統器官組織。AQP8可促進水、H2O2通過細胞膜[4],參與維持線粒體的正常功能及膽汁分泌[5-6]。AQP9可以使水、甘油和尿素穿過細胞膜,參與肝細胞糖異生,也有報道AQP9與毛細膽管的膽汁分泌有關[7]。然而,AQP在ALD中的表達和分布情況目前鮮有報道。

本研究主要通過Western blot、組織免疫組化染色及免疫電鏡等實驗方法,探索在ALD大鼠模型中AQP3、8和9的表達及亞分布情況。

材 料 和 方 法

實驗動物及設備18只雄性SD大鼠[(250±10) g,上海斯萊克實驗動物公司];Lieber-DeCarli配對ALD液體造模飼料(江蘇南通特洛菲動物飼料公司);real-time PCR檢測儀(型號:ABI7500,美國ABI公司);Trizol (美國Invitrogen公司);含DNA酶的RNA逆轉錄試劑盒,SYBR Green PCR試劑盒(日本Takara公司);AQP3/8/9兔抗大鼠一抗(美國Alomone Laboratories公司);10 nm膠體金標記的山羊抗兔的二抗(美國Abcam公司);膜漿蛋白提取試劑盒(上海碧云天公司)。

動物分組經過1周的環境適應后,18只雄性SD大鼠被隨機等分為3組,即:正常對照(normal control,NC)組,造模對照(Pair-fed,PF)組和酒精造模(Ethanol,EtOH)組。將各組大鼠飼養于標準的SPF級環境中。

SD大鼠ALD模型建立NC組大鼠給予正常嚙齒固體飼料。PF組和EtOH組配對喂養含有相當于18%的蛋白、11%的碳水化合物、35%的脂肪和36%乙醇或者等麥芽糖-糊精混合物(均為熱量配比)的造模用液體飼料。EtOH組自由喂食含酒精的Lieber-DeCarli液體飼料,使飼料中的酒精提供的熱量每兩天增加2%,直至酒精熱量占進食液體飼料總熱量的36%。造模時間共6周。

病理學檢測4%甲醛固定肝臟、回腸和結腸組織,石蠟包埋,組織蠟塊切片(約5 μm),用于HE染色和免疫組化染色。為了檢測肝臟的脂肪含量,肝臟冰凍切片按照文獻所述方法用油紅O染色[8]。

免疫組化染色將石蠟切片用檸檬酸修復液加熱修復,3% BSA封閉1 h,AQP3/8/9一抗(1∶100稀釋) 4 ℃孵育過夜。二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h,辣根過氧化物酶底物用于信號檢測,最后將切片用蘇木精復染。

免疫電鏡檢測新鮮的肝臟組織用2.5%的戊二醛固定后按照之前的文獻方法處理切片。超薄的肝臟切片分別用兔抗大鼠的AQP8或者AQP9一抗于4 ℃ 孵育 36 h,然后用膠體金標記的二抗(1∶50稀釋)。用電子顯微鏡(JEOL-1230)拍照記錄。

實時熒光定量PCR使用Trizol提取肝臟、回腸和結腸組織中的總RNA并逆轉錄為cDNA。將等量cDNA 作為模板用于PCR反應。目的基因mRNA相對表達情況用該基因與β-actin的2-ΔΔCt比值來計算。qRT-PCR 的引物序列見表 1。

Westernblot分別提取新鮮的肝臟、回腸和結腸組織膜蛋白和漿蛋白。將30 μg蛋白用于SDS/PAGE電泳,恒流310 mA,1.5 h轉膜。3%脫脂牛奶室溫封閉1 h,AQP3、AQP8、AQP9和β-actin一抗(1∶1 000稀釋) 4 ℃過夜孵育,二抗 (1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h,ECL曝光液檢測免疫反應。

統計學分析所有數據使用 SPSS 21.0進行統計,采用One-way ANOVA分析檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

表1　qRT-PCR引物Tab 1　Primers of qRT-PCR

結　　　果

慢性飲酒可以導致大鼠肝臟輕微損傷EtOH組的大鼠肝臟細胞有明顯損傷,電鏡下表現為線粒體水腫,線粒體嵴減少和紊亂,內質網空泡化,以及毛細膽管形態異常等 (圖 1、2)。HE染色結果表明,EtOH組大鼠的肝臟有明顯的脂肪變性但并未出現明顯的纖維化或炎癥 (圖1A～C) 。

A,B and C (bar=10μm):Light microscopic images of HE stained liver tissues.After chronic alcohol intake,significant vacuolization which represented macrovesicular steatosis was observed in the hepatocytes distributed in acinar zone 1 and 2,close to the portal tracts in EtOH group.D,E and F (bar=10μm):Light microscopic images of oil red O staining of liver tissues.G,H and I (bar=1μm):The general images of single hepatocyte under transmission electron microscopy (TEM).CV:Central vein;PT:Portal triad;N:Nucleus.

圖1飲酒刺激后大鼠肝細胞的病理學表現
Fig1Histologicalchangesinrathepatocytesafteralcoholconsumption

A,B and C (bar=0.5μm):Swelling mitochondria,reduced and derangement of mitochondrial cristae under TEM,also ER vesiculation could be seen in EtOH hepatocytes (single white color arrow marked).D,E and F (bar=1μm):Changes in hepatic bile canaliculus structure in NC,PF and EtOH groups.The boundary of hepatic bile canaliculus was blurred in EtOH group (marked by 3 white arrows).M:Mitochondria;N:Nucleus;B:Bile canaliculus;F:Fatty drops;TJ:Tight junction;ER:Endoplasmic reticulum.

圖2透射電鏡下的大鼠肝細胞線粒體和毛細膽管
Fig2Hepatocellularmitochondriaandbilecanaliculusundertransmissionelectronmicroscopyinrats

A:The immunohistochemistry staining of AQP8 and AQP9 in liver tissues under light microscopy (×200);B:Cytoplasmic and membranous expression of AQP8 and 9 in rat liver after different treatments through immunoblot assay (NC:Normal control;PF:Pair-fed;EtOH:Ethanol-fed).β-actin was used as a loading control.M:Membranous;C:Cytoplasmic;M/C:Membranous/Cytoplasmic ratio.EtOHvs. PF,(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖3酒精刺激后大鼠肝臟AQP的表達和分布
Fig3ExpressionanddistributionofAQPsinlivertissuesinratsafteralcoholintake

慢性飲酒導致大鼠肝臟AQP表達失調AQP8和AQP9在大鼠肝臟均有分布,如圖3A所示,較弱的AQP8表達于近中央靜脈的肝臟細胞;較強的AQP9分布于近肝血竇的肝細胞膜。由圖4可見,AQP8、AQP9分布于線粒體內膜(inner mitochondrial membranes,IMMs)、毛細膽管膜(bile canaliculus membrane,BCM)等亞細胞結構。相較于對照組,酒精攝入可以減少AQP8在BCM和IMMs的分布,而增加AQP9在BCM的分布。

A,B and C:AQP8 localization in hepatocellular bile canaliculus membrane with colloidal gold particles labeling (arrows);D,E and F:AQP8 localization in inner mitochondrial membrane with colloidal gold particles labeling (arrows);A1,B1 and C1:AQP9 localization in hepatocellular bile canaliculus membrane with colloidal gold particles labeling (arrows);D1,E1 and F1:AQP9 distribution in inner mitochondrial membrane with colloidal gold particles labeling (arrows).M:Mitochondria;B:Bile canaliculus.

圖4AQP8和AQP9在大鼠肝細胞中的免疫電鏡染色結果(×40000)
Fig4ImmunoelectronmicroscopyforAQP8andAQP9inlivertissuesinrats(×40000)

AQP可以儲存于IV或細胞膜上,而只有當AQP分布于細胞膜時才能發揮轉運功能。因此我們分別檢測了細胞膜和細胞質內AQP的表達情況。如圖3B顯示,慢性酒精攝入后AQP8在大鼠肝細胞膜上的表達水平增加(P<0.05),而細胞質內AQP8表達水平及AQP8膜/質比沒有明顯變化。EtOH組大鼠肝臟細胞膜上AQP9的表達水平、AQP9膜/漿比均增加(P<0.01)。但是EtOH組AQP8和AQP9的mRNA表達水平均無明顯變化。

慢性酒精攝入導致回腸AQPs表達異常研究顯示小腸屏障功能失調參與ALD的發病過程,而AQP3對維持腸道屏障完整性有重要作用[3]。如圖5A 所示,AQP3、8和9主要分布于回腸上皮細胞的頂端膜上。

如圖5B所示,慢性酒精攝入后大鼠回腸組織細胞膜和胞質AQP3的表達量均減少(PC<0.01,PM<0.01);AQP3膜/質比上調(P<0.01)。AQP8 細胞膜的表達水平沒有明顯改變,但AQP8在細胞質明顯減少(P<0.05),且AQP8膜/質比明顯上調 (P<0.01)。這些說明AQP3、AQP8有可能受到重新分布的調控。AQP9在細胞膜和細胞質的表達量均減少(P<0.01),而AQP9膜/質比也明顯降低(P<0.01)。慢性飲酒后回腸組織AQP3、AQP8 和AQP9mRNA的表達水平的差異無明顯統計學意義。

慢性飲酒導致大鼠結腸組織AQP表達失調AQP3、8和9主要分布于結腸上皮細胞頂端膜上(圖6A)。如圖6B所示,飲酒刺激后,AQP8 和 AQP9 在結腸組織細胞膜上的蛋白表達水平下降(P<0.01),AQP8、AQP9的膜/質比下調 (P<0.01) 。但慢性飲酒后結腸組織AQP3、AQP8和AQP9 mRNA 的表達水平變化無統計學意義。

A:The immunohistochemistry staining of AQP3,AQP8 and AQP9 in ileum tissues under light microscopy (×200);B:Cytoplasmic and membranous expression level of AQP3,AQP8 and AQP9 in ileum tissues through immunoblot assay.β-actin was used as a loading control.EtOHvs. PF,(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖5大鼠回腸AQP的表達和分布
Fig5ExpressionanddistributionofAQPsinileumtissuesinrats

討　　　論

ALD目前已經成為全球慢性肝病的重要病因之一。腸道菌群失調等導致的腸道屏障損傷、肝臟脂質代謝異常參與ALD的發病過程。AQP作為影響小分子運輸的跨膜蛋白,對于維持細胞正常生命活動起到至關重要的作用。因此,從表達、分布和調節等方面深入探討AQP對全面了解ALD有重要意義。

ALD臨床上主要表現為肝臟不同程度的損傷。目前在大鼠和人類肝臟中表達的AQP家族中被研究最多的是AQP8和AQP9。本研究通過免疫電鏡發現AQP8、AQP9分布于IMMs和BCM等亞細胞結構。我們的研究發現,給予大鼠飲酒刺激并不明顯影響肝臟AQP8和AQP9的mRNA表達水平,但是顯著增加了AQP8、AQP9蛋白在肝細胞膜上的分布。AQP8膜分布上調可能會增加肝細胞對H2O2的通透性,從而促進肝細胞的過氧化應激損傷。此外,AQP9的膜/質比增加說明可能存在一種機制將肝細胞內的AQP9重新分布于細胞膜,從而增加AQP9的功能活性。AQP9是肝臟中唯一與肝細胞攝取甘油相關的跨膜蛋白,AQP9功能異常與代謝綜合征的脂質代謝紊亂有明顯關系[9],飲酒增加肝細胞膜AQP9的分布可能與肝臟脂肪變、脂質代謝紊亂有關,肝細胞膜AQP9分布增加也可增加肝細胞對H2O2的敏感性[10]。慢性飲酒后,大鼠肝臟毛細膽管中AQP8的分布減少而AQP9的分布增加,說明在飲酒引起的肝臟脂肪變早期階段,酒精可能已經通過影響AQP8和AQP9的分布及毛細膽管水分的分泌從而逐步影響膽汁分泌過程。飲酒后大鼠肝臟細胞線粒體受到嚴重損傷,形態異常,線粒體嵴減少、紊亂,免疫電鏡顯示線粒體上AQP8的分布減少,而AQP8參與維持線粒體體積、H2O2轉運從而保證線粒體正常氧化磷酸化反應[11],因此線粒體AQP8的分布減少可能與肝臟過氧化應激損傷有關。目前研究認為氧化應激反應是酒精誘導的肝臟損傷的重要環節之一,因此可以認為AQP8和AQP9通過介導氧化應激反應參與酒精誘導的肝細胞損傷。

A:The immunohistochemistry staining of AQP3,8 and 9 in colon tissues under light microscopy (bar=10μm);B:Cytoplasmic and membranous expression level of AQP3,AQP8 and AQP9 in colon tissues.EtOHvs. PF,(1)P<0.01.

圖6飲酒后大鼠結腸AQP的表達和分布
Fig6ExpressionanddistributionofAQPsincolontissuesofratsafteralcoholintake

腸道上皮再生和完整性對維持腸道屏障有重要影響,而腸道屏障損傷是ALD的重要發病機制之一[12-13]。AQP3、8和9在大鼠腸道廣泛分布。近來文獻報道AQP3和AQP9分別通過參與腸道上皮的再生、小腸杯狀細胞分泌黏液等生理活動從而對維持腸道屏障的完整性有重要作用[3,14]。AQP8表達下降與結腸的炎癥反應有關。本研究證明飲酒刺激后,大鼠AQP3和AQP9在回腸細胞膜的表達減少,AQP8和AQP9在結腸細胞膜的表達減少,證明飲酒可能通過影響AQP的細胞膜表達影響腸道修復能力從而損傷腸道屏障功能,從而參與ALD的發病過程。

目前為止,AQP可以通過3種主要機制調節其表達情況:(1)轉錄或翻譯水平的調節;(2)蛋白構象的改變;(3)在某些刺激因素(如激素分泌和信號通路活化)的作用下發生蛋白在細胞膜與細胞質之間分布的轉移實現AQP的重新分布,從而影響AQP的蛋白功能并參與許多疾病的發生過程[15-16]。后續的研究將集中于AQP3、8和9在ALD表達和亞細胞分布的調節機制及相關功能的驗證,這將為全面了解ALD的發病機制提供新的思路。

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