大鼠腎系膜細(xì)胞飾膠蛋白聚糖乙酰化可增強(qiáng)其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和功能

李元臣　徐玉音　劉　曦　丁心怡　吳慧娟,3　張志剛,3

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系　上海　200032; 2復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院2008級(jí)臨床醫(yī)學(xué)八年制　上海　200032;3上海市腎臟疾病與血液凈化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　上海　200032)

乙酰化作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種方式,在參與染色體結(jié)構(gòu)、DNA損傷修復(fù)、維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定,以及在蛋白質(zhì)相互作用中具有十分重要的功能[1-3]。其主要修飾形式是在乙酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下將乙酰基添加到蛋白質(zhì)分子中賴氨酸殘基的ε-NH2上。研究顯示,由于同樣作用于蛋白質(zhì)的賴氨酸,乙酰化還與蛋白質(zhì)泛素化修飾有交叉作用或競(jìng)爭(zhēng)作用,從而影響蛋白質(zhì)的代謝和活性[4]。如在信號(hào)分子Smad7乙酰化研究中發(fā)現(xiàn),Smad7 的K64和K70位點(diǎn)的賴氨酸發(fā)生乙酰化后,可阻斷Smad7 的泛素化降解,并影響smad7 的作用[5]。

飾膠蛋白聚糖(decorin,DCN)是一類相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白聚糖,廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)中[6]。研究發(fā)現(xiàn)DCN參與多種細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控過程,DCN的高表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等[7]。在腎臟疾病研究中發(fā)現(xiàn),DCN是腎系膜細(xì)胞 (mesangial cell,MsC) 分泌的重要分子,可以通過拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)的作用,抑制腎MsC生長(zhǎng)和基質(zhì)合成[8]。動(dòng)物試驗(yàn)證明,腎動(dòng)脈注射外源性DCN可拮抗大鼠抗Thyl.1腎炎模型中的病變,抑制MsC增生及腎小球纖維化的程度和進(jìn)展[9],提示DCN是重要的抗腎炎因子。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)腎系膜細(xì)胞DCN可通過泛素化修飾,并經(jīng)蛋白酶體(proteasome)途徑降解[10]。此外,Lundby等[11]在研究細(xì)胞中蛋白質(zhì)的乙酰化修飾位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn),在DCN中存在著潛在的乙酰化修飾位點(diǎn)。然而迄今為止尚未有實(shí)驗(yàn)報(bào)道DCN乙酰化修飾。本文研究了大鼠腎系膜細(xì)胞DCN的乙酰化修飾及其對(duì)MsC生物學(xué)功能的影響。通過免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在腎MsC中存在DCN乙酰化修飾,且DCN的乙酰化修飾可抑制DCN泛素化降解,促進(jìn)了DCN蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。增強(qiáng)DCN的乙酰化修飾可促進(jìn)TGF-β1以及Ⅳ型膠原的下調(diào),同時(shí)抑制腎MsC的生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明,系膜細(xì)胞DCN乙酰化修飾可增強(qiáng)DCN抗腎炎的作用。

材 料 和 方 法

抗體試劑鼠抗DCN單抗(美國(guó)R&D公司);p300抗體(美國(guó)Abcom公司);兔抗乙酰化多克隆抗體、鼠抗ubiquitin抗體(縮寫為抗Ubi,下文同)、鼠抗β-actin單抗,去乙酰化酶抑制劑(trichostatin A,TSA;nicotinamide,NAM)以及蛋白酶體阻斷劑MG-132 (美國(guó)Sigma-Aldrich公司);DCN-siRNA由上海拓然生物科技有限公司合成;放線菌酮(cycloheximide,CHX)購于上海生工公司,PCR引物由蘇州金唯致生物科技有限公司合成;免疫共沉淀試劑盒Protein-A Sepharose CL-4B購自美國(guó)Amersham Biosciences公司。

正常MsC培養(yǎng)體外培養(yǎng)的大鼠腎MsC為本實(shí)驗(yàn)室分離保存,實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為6～15代。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),采用含10% 小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2、95% 空氣飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),適時(shí)傳代。

免疫共沉淀上述細(xì)胞抽提蛋白質(zhì)。細(xì)胞蛋白質(zhì)提取液中分別加入1 mg 抗DCN 抗體、抗乙酰化蛋白質(zhì)抗體、抗Ubi,4 ℃搖床過夜孵育,次日于蛋白質(zhì)提取液與抗體混合物中加入30 μL Protein-A Sepharose CL-4B (按試劑盒說明操作),4 ℃搖床繼續(xù)孵育2 h,TBS清洗珠子5次,清洗后的珠子最后加入60 μL的TBS進(jìn)行重懸,加入6×SDS 加樣緩沖液煮沸5 min,使蛋白質(zhì)變性并從珠子上脫落下來,取上清進(jìn)行Western blot,檢測(cè)目標(biāo)蛋白之間是否存在著相互結(jié)合的作用。

Westernblot收集及裂解細(xì)胞后,離心提取細(xì)胞總蛋白。蛋白收集后經(jīng)BCA方法進(jìn)行定量,每組取約70 μg蛋白,煮沸變性。經(jīng)8%SDS-PAGE分離,并電轉(zhuǎn)到PVDF膜,含5%脫脂奶粉的PBS封閉30 min,加相應(yīng)一抗4 ℃搖床過夜孵育。第二天加入HRP標(biāo)記的二抗,再由ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè),以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行分析。為檢測(cè)經(jīng)去乙酰基酶抑制劑NAM+TSA處理后,MsC 內(nèi)DCN 半衰期的改變檢測(cè),采用Time-course Western blot法,采用10 μg/L蛋白質(zhì)合成抑制劑( CHX) 處理MC后,分別于0、6、12、24 和48 h 終止培養(yǎng)并提取細(xì)胞總蛋白,其余步驟同Western blot。

總RNA提取和RT-PCR總RNA 提取按照Trizol 試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為25 μL 反應(yīng)體系,包含2 μg的總RNA,1 μL M-MLV (200 U/μL)逆轉(zhuǎn)錄酶和3 μL Oligo ( dT)18(100 μg/μL)。PCR條件為95 ℃變性12 min,95 ℃變性30個(gè)循環(huán)45 s,56 ℃( DCN) 和58 ℃ ( β-actin) 退火30 s,72 ℃延伸40 s,72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL,進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳。DCN PCR引物如下:5′-TGGCAGTCTGGCTAATGT-3′ 和5′-ACTCAC-GGCAGTGTAGGA-3′;β-actin引物:5′-AGGA-TGCAGAAGGAGATTACTGC-3′ 和5′-AAAAC-GCAGCTCAGTAACAGTGC-3′。DCN和β-actin的PCR產(chǎn)物大小分別為199和220 bp。

流式細(xì)胞儀分析收集細(xì)胞,并用預(yù)冷的PBS洗2遍后轉(zhuǎn)移至EP管中,清洗后的細(xì)胞用預(yù)冷的檸檬酸鈉固定液重懸,混勻后-20 ℃過夜固定細(xì)胞。第2天將固定過的細(xì)胞經(jīng)1 700 r/min (離心半徑r=8 cm)離心12 min后,緩慢吸出檸檬酸鈉,保留細(xì)胞沉淀并用PBS清洗細(xì)胞2次,清洗后保留約100 μL的細(xì)胞懸液體系。于細(xì)胞懸液中加入約20 μL RNase酶,37 ℃水浴1～1.5 h后,加入100 μL稀釋好的1×PI染液,避光染核30 min,染核后,2 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),每個(gè)樣本分析10 000個(gè)核,并分析每個(gè)樣本中G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞的數(shù)目,計(jì)算出細(xì)胞在各時(shí)期所占百分比,并對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

結(jié)　　　果

腎MsC中DCN的泛素化修飾應(yīng)用免疫共沉淀檢測(cè)MsC中泛素與DCN的結(jié)合情況,正常MsC總蛋白經(jīng)用DCN單抗免疫沉淀,Ubi單抗檢測(cè),結(jié)果如圖1A所示,實(shí)驗(yàn)組1在130 000位置及以上出現(xiàn)間斷性蛋白質(zhì)拖帶,提示為泛素化DCN的條帶,下圖用DCN抗體證實(shí)DCN被抗體沉淀。反向,MsC總蛋白IP利用Ubi單抗免疫沉淀,IB用DCN單抗檢測(cè),如圖1B所示,在130 000也可見泛素化DCN的條帶,表明DCN經(jīng)泛素化修飾調(diào)節(jié)。

A:1,Test group,there is intermittent smearing bands in about 130 000;2,IgG antibody negative control group;3,IP:DCN supernatant control group;4,Normal MsC total protein (Western blot) positive control group.B:1,Test group,a band in 130 000 appeared too;2,IgG antibody negative control group;3,IP:Ubi supernatant control group;4,Normal MsC total protein (Western blot) positive control group.Ubi:Ubiquitin.

圖1免疫共沉淀檢測(cè)DCN泛素化
Fig1DCNubiquitinationdetectedbyimmunoprecipitation

DCN乙酰化修飾為了驗(yàn)證大鼠腎MsC內(nèi)的DCN是否存在乙酰化,我們應(yīng)用DCN抗體進(jìn)行免疫共沉淀,再用抗乙酰化抗體和抗DCN抗體電泳進(jìn)行分析。結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)組正常MsC在130 000位置可以檢測(cè)到乙酰化修飾的DCN表達(dá)(圖2);MsC經(jīng)用去乙酰基酶抑制劑NAM和TSA處理后,乙酰化修飾的DCN表達(dá)量有明顯的上調(diào)(圖2A)。同時(shí),再通過反向免疫沉淀來進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,正常MsC與用去乙酰基酶抑制劑NAM和TSA處理后,細(xì)胞的提取蛋白質(zhì)經(jīng)乙酰化抗體免疫共沉淀后,通過使用DCN的抗體也可以明顯檢測(cè)到DCN的表達(dá)(圖2B)。表明大鼠腎MsC DCN存在乙酰化修飾。

P300質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎MsC促進(jìn)DCN乙酰化P300是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,可促進(jìn)組蛋白和非組蛋白的乙酰化,從而在多種細(xì)胞生命活動(dòng)中起重要作用[12]。為觀察P300促進(jìn)DCN乙酰化作用后的改變,我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組P300質(zhì)粒到MsC中過表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞蛋白質(zhì)的乙酰化程度。結(jié)果顯示,在P300質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎MsC后,P300蛋白表達(dá)增強(qiáng)(圖3A)。同時(shí),與對(duì)照組相比,DCN的水平也增加(圖3 B),提示增強(qiáng)乙酰化修飾可以促進(jìn) DCN的穩(wěn)定性,減少降解。

A:IP,DCN;IB,anti-DCN and anti-acetyl antibody;MsC,normal mesangial cell;IgG,Negative control;NAM+TSA,MsC treated with NAM+TSA.B:IP,anti-acetyl;IB,anti-DCN .

圖2免疫共沉淀檢測(cè)MsC中DCN乙酰化修飾
Fig2AcetylationofDCNdetectedbyimmunoprecipitationinmesangialcell

A:The P300 protein level increased in MsC/P300 cell which was transfected by P300 plasmid.B:Acetylation of DCN was increased in MsC/P300 cell which was transfected by P300 plasmid.C:Statistichistogram of the acetyl-DCN expression in MsC and MsC/P300 cells of Fig3 B.MsC:Normal MsC group;MsC/P300:MsC transfected by P300.

圖3P300質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后DCN的乙酰化檢測(cè)
Fig3AcetylationofDCNwasdetectedinmesangialcellstransfectedbyP300plasmid

去乙酰基酶抑制劑促進(jìn)了DCN蛋白質(zhì)的穩(wěn)定進(jìn)一步采用去乙酰基酶抑制劑NAM和TSA處理,發(fā)現(xiàn)也可促進(jìn)蛋白質(zhì)的乙酰化修飾,因二者抑制去乙酰基酶的途徑不同,實(shí)驗(yàn)使用NAM和TSA分別處理大鼠腎MsC。通過Western blot檢測(cè)DCN蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,與對(duì)照組相比,NAM和TSA單獨(dú)處理均可以增加DCN的蛋白質(zhì)水平,且DCN的蛋白質(zhì)水平在NAM處理4 h后顯著高于8 h,而TSA單獨(dú)處理細(xì)胞后DCN蛋白質(zhì)水平在12 h達(dá)到最大值。該結(jié)果表明NAM和TSA均可促進(jìn)DCN乙酰化修飾和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定(圖4A)。同時(shí)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑處理后顯示DCN水平升高(圖4B),提示乙酰化作用與MG132的作用有一致性。但兩者作用機(jī)制不同,表明DCN的乙酰化可能抑制了DCN的泛素化降解過程,而達(dá)到穩(wěn)定性提高。

去乙酰基酶抑制劑延長(zhǎng)DCN的半衰期為了進(jìn)一步證明DCN的乙酰化可以抑制其蛋白的降解,促進(jìn)其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,我們檢測(cè)了DCN的半衰期,比較增強(qiáng)DCN乙酰化后的降解速度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,在蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理后,正常對(duì)照組中DCN在180 min衰減至半數(shù)水平,但經(jīng)NAM+TSA處理后,DCN蛋白的降解速度明顯減慢,半衰期顯著延長(zhǎng)。結(jié)果表明DCN的乙酰化修飾減慢了DCN蛋白降解的速度,延長(zhǎng)了DCN的半衰期,促進(jìn)了DCN的蛋白穩(wěn)定性。

A:Detection of the DCN protein levelin mesangial cells treated with TSA and NAM at different times.B:Detection of the DCN protein level in mesangial cells treated with TSA+NAM and MG 132.(1)P<0.01.

圖4去乙酰化酶抑制劑或MG132處理MsC后DCN蛋白的表達(dá)
Fig4DetectiontheDCNproteinlevelinmesangialcellstreatedwithdeacetylaseinhibitororMG132

A:The mesingial cells was treated by CHX for stopping protein synthesis,then the expression of DCN was determined in mesangial cells treated with or without TSA+NAM (reference:β-actin).B:The degradation rate of DCN protein in mesangial cells treated with or without TSA+NAM showed by statistic histogram.

圖5DCN蛋白質(zhì)乙酰化抑制了其蛋白質(zhì)的降解速度
Fig5DCNacetylationinhibitedthedegradationrateofDCNprotein

去乙酰基酶抑制劑不影響DCN的轉(zhuǎn)錄水平為了明確DCN蛋白質(zhì)水平的升高是由DCN蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)節(jié)所造成,而不是由轉(zhuǎn)錄水平提高引起,我們使用RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組、NAM處理組、TSA處理組和NAM+TSA處理組中DCN的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,各組之間DCN的轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。該結(jié)果表明NAM和TSA處理沒有影響DCN的轉(zhuǎn)錄水平,其所引起的DCN蛋白質(zhì)水平的升高,是通過轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)改變所引起。

DCN乙酰化下調(diào)MsC中TGF-β1和Ⅳ型膠原表達(dá)本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明DCN過表達(dá)可以明顯抑制TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)。為了驗(yàn)證DCN的乙酰化修飾對(duì)其蛋白質(zhì)活性的影響,實(shí)驗(yàn)檢

圖6　NAM和TSA處理后MsCDCN的mRNA水平檢測(cè)Fig 6　Detection of DCN mRNA level in mesangialcells treated by NAM and TSA

測(cè)了NAM和TSA處理MsC后,TGF-β1以及Ⅳ型膠原的表達(dá)情況。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,在NAM和TSA刺激組中,DCN的蛋白質(zhì)水平有明顯的上調(diào),同時(shí)TGF-β1以及Ⅳ型膠原的表達(dá)也有明顯下降(圖7)。該結(jié)果表明乙酰化修飾不僅穩(wěn)定MsC的DCN蛋白質(zhì),也增強(qiáng)DCN對(duì)TGF-β1以及Ⅳ型膠原表達(dá)的調(diào)控。

DCN的乙酰化修飾抑制腎MsC的增殖為進(jìn)一步檢測(cè)DCN的乙酰化修飾是否對(duì)大鼠腎MsC的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,我們通過NAM或TSA單獨(dú)處理細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)大鼠腎MsC的細(xì)胞周期變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8A所示,與對(duì)照組相比,在NAM或TSA處理組中,細(xì)胞停滯在G1期的比例明顯增加,G2/M期比例明顯減少(表1)。結(jié)果表明DCN的乙酰化修飾不僅抑制DCN泛素化降解,還保持了DCN抑制腎MsC生長(zhǎng)的作用。同時(shí),為確定影響MsC 生長(zhǎng)受DCN調(diào)節(jié)的特異性,我們進(jìn)一步用DCN-siRNA 敲低細(xì)胞的DCN表達(dá)(圖8 B),則MsC的生長(zhǎng)重新加快,G2/M期比例發(fā)現(xiàn)開始增加(表2)。進(jìn)一步證實(shí)上述增強(qiáng)乙酰化導(dǎo)致MsC生長(zhǎng)抑制是增強(qiáng)了DCN的作用所致。

A:Western blot detected the proteinlevels of TGF-β1 and type IV collagen in mesangial cells treated by NAM and TSA.B:Statistical graph showed DCN level increasing in NAM and TSA group.C:Statistical graph showed TGF-β1 level decreasing in NAM and TSA group.D:Statistical graph showed Type IV collagen level decreasing in NAM and TSA group.(1)P<0.01.

圖7DCN的乙酰化修飾對(duì)TGF-β1以及Ⅳ型膠原表達(dá)的影響
Fig7TheeffectofDCNacetylationontheexpressionofTGF-β1andtypeⅣcollagen

GroupG0/G1G2/MControl54.86±1.7945.14±2.68NAM62.31±0.6037.69±5.07(1)TSA61.98±1.74(1)39.02±9.31(1)

vs.control group,(1)P<0.05.

A:Flow cytometry detected the cell cycle of mesangial cells treated by NAM and TSA.B:The detection of DCN expression in MsC after being transfected by DCN-siRNA.

圖8DCN的乙酰化抑制腎MsC的增殖
Fig8TheacetylationofDCNinhibitstheproliferationofMsC

GroupG0/G1G2/MMsC70.33±3.1529.67±1.63MsC/DCN-siRNA67.43±4.2732.57±3.29(1)

vs.normal control,(1)P<0.05.

討　　　論

蛋白質(zhì)的功能不僅由其基因水平?jīng)Q定,蛋白質(zhì)翻譯后的修飾對(duì)其也具有十分重要的調(diào)節(jié)作用[1,4]。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)在大鼠腎MsC質(zhì)中DCN可被泛素化修飾并通過蛋白酶體途徑降解[10]。Lundby等[11]在蛋白質(zhì)乙酰化調(diào)節(jié)位點(diǎn)的研究中發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)質(zhì)譜學(xué)證實(shí)了DCN蛋白質(zhì)存在多個(gè)乙酰化修飾位點(diǎn)。但有關(guān)DCN的乙酰化還未見報(bào)道。已知泛素化以及乙酰化修飾都發(fā)生在賴氨酸的殘基上,特別在某些蛋白質(zhì)的K64位和K70位賴氨酸殘基是結(jié)合泛素分子的重要位點(diǎn),也是容易被乙酰化的部位。因此,同一蛋白質(zhì)的乙酰化和泛素化修飾之間存在著一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[5,13]。乙酰化修飾常可引起靶蛋白泛素化作用抑制,使底物蛋白減少降解,如Smad7乙酰化可阻斷Smad7 的泛素化降解[5]。如果增強(qiáng)蛋白質(zhì)泛素化調(diào)節(jié),也會(huì)影響乙酰化的作用,已知p53主要通過乙酰化進(jìn)行調(diào)節(jié),而近來研究發(fā)現(xiàn),通過增強(qiáng)p53泛素連接酶Mdm2的表達(dá),可促進(jìn)p53泛素化,抑制p53 的乙酰化修飾[13]。類似現(xiàn)象出現(xiàn)在許多蛋白質(zhì)分子調(diào)節(jié)作用中,如Runx3[14]、p73[15]等。因此我們假設(shè)MsC中泛素化的DCN可能也存在著乙酰化,并與 DCN泛素化之間存在競(jìng)爭(zhēng)調(diào)節(jié),從而影響MsC的生物學(xué)表型的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證在大鼠腎MsC中DCN是否也受到乙酰化調(diào)控,本研究通過免疫共沉淀、Western blot等實(shí)驗(yàn),對(duì)細(xì)胞中乙酰化的DCN進(jìn)行檢測(cè)。正常時(shí),MsC分泌的DCN水平較低,在炎癥或纖維組織增生的條件下DCN分泌增多,并很快與基質(zhì)中的膠原成分結(jié)合沉積。為了避免大鼠腎MsC中DCN乙酰化水平過低而不能被抗體很好檢測(cè)到,實(shí)驗(yàn)中還通過添加去乙酰基酶抑制劑NAM和TSA來促進(jìn)細(xì)胞中蛋白的乙酰化水平。結(jié)果顯示在大鼠腎MsC中存在著乙酰化修飾的DCN,且去乙酰基酶抑制劑可促進(jìn)DCN的乙酰化修飾,此外,DCN的乙酰化修飾抑制了DCN在細(xì)胞中的降解速度,增強(qiáng)了DCN在細(xì)胞中的穩(wěn)定。

DCN因其分子結(jié)構(gòu)與TGF-β1相似,可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TGF-β1受體,從而拮抗TGF-β1的刺激作用,抑制大鼠腎MsC生長(zhǎng)和基質(zhì)合成[16]。同時(shí)有報(bào)道顯示在人腎小球MsC中過表達(dá)外源性的DCN,可下調(diào)TGF-β1和Ⅳ型膠原及纖連蛋白在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)[17]。本研究發(fā)現(xiàn),NAM和TSA可促進(jìn)DCN的乙酰化修飾,同時(shí)下調(diào)TGF-β1和Ⅳ型膠原的表達(dá)。該結(jié)果表明DCN的乙酰化修飾不僅可抑制DCN的降解代謝,而且可增強(qiáng)DCN的功能,從而影響MsC的基質(zhì)合成等功能。

Isaka等[18]曾經(jīng)用病毒載體將DCN質(zhì)粒注入大鼠的大腿肌肉中,使血液DCN含量增加,從而抑制了大鼠腎炎MsC增生及腎炎病理改變。本課題組也曾報(bào)道,腎臟MsC中過量表達(dá)DCN蛋白質(zhì)時(shí)可以抑制腎臟MsC的生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[19]。本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCN的乙酰化對(duì)細(xì)胞周期的影響,結(jié)果顯示DCN的乙酰化使大鼠腎MsC進(jìn)入G1期的比例明顯增多,G2/M期比例明顯減少。而用DCN的RNA干擾減少DCN的表達(dá),又可促進(jìn)MsC的生長(zhǎng),表明增強(qiáng)DCN乙酰化可以通過競(jìng)爭(zhēng)DCN的賴氨酸殘基,減少蛋白質(zhì)的泛素化調(diào)節(jié)和降解,從而促進(jìn)DCN蛋白的穩(wěn)定和活性,抑制MsC的生長(zhǎng),拮抗腎炎病變發(fā)展。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示增強(qiáng)DCN乙酰化調(diào)節(jié)在防治MsC增生性腎炎的研究中可作為潛在的干擾靶點(diǎn)。

綜上所述,DCN是一種重要的抗腎炎因子。本研究結(jié)果表明DCN的乙酰化可抑制DCN的泛素化降解,增進(jìn)了DCN蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和活性,在抑制MsC的基質(zhì)合成及細(xì)胞增生的過程中發(fā)揮一定的作用。因此,研究DCN乙酰化對(duì)于更深入研究DCN的功能以及DCN在治療腎病過程中的作用提供了新的思路。

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