FHL1對肺腺癌細胞株A549生物學特性的影響

季春華　劉　輝　向　明

(復旦大學附屬上海市第五人民醫院胸外科　上?！?00240)

目前肺癌的發病率及死亡率居所有惡性腫瘤之首。而且近些年來肺癌,尤其是晚期肺癌治療后的5年生存率提高并不大,分子靶向藥物在肺癌治療中的地位逐年提高,因此,新的分子靶向基因及藥物的研究十分必要。FHL1(four and a half LIM domain protein 1)是近年來研究發現的一種腫瘤抑制因子,表達于人體的多種正常細胞以及腫瘤細胞中[1]。FHL1在多種實體腫瘤細胞中呈低表達,而且其表達水平與腫瘤的進展呈負相關[2]。我們通過在體外細胞實驗中改變FHL1在肺腺癌細胞株中的表達,研究其對肺腺癌細胞株生物學特性的影響,為進一步的實驗研究提供基礎,以期將來能為肺腺癌的診斷治療提供新的思路。

材 料 和 方 法

材料和試劑本實驗所用肺腺癌細胞株A549、人源FHL1-mRNA慢病毒及人源FHL1 shRNA慢病毒套裝購自上海匠萊生物科技有限公司;FHL1抗體購自美國Abcam公司(批號ab58067);CCK8試劑盒、Takara逆轉錄試劑盒、SYBR Green Master Mixes 試劑盒、Transwell小室等實驗試劑器材均購自上海豐能醫藥科技有限公司。

實驗方法

FHL1在非小細胞肺癌中的本底表達選取A549細胞進行實驗,檢測FHL1基因在mRNA水平上的表達情況,即本底表達水平。接種細胞,取對數期A549細胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養基配成單細胞懸液,計數,接種至6孔板中,于37 ℃,5% CO2細胞培養箱中預培養24 h。

收集細胞,使用Trizol/三氯甲烷/異丙醇法提取細胞總RNA,定量,將RNA逆轉錄成cDNA,以U6 為內參,以cDNA 為模板進行RT-PCR擴增FHL1。由PCR 反應曲線得到的Ct 值計算,按公式2-△△Ct計算細胞株中FHL1 mRNA 相對表達量。

FHL1穩轉過表達和低表達細胞株構建及鑒定針對之前的結果,我們設計過表達和低表達實驗,合成FHL1 mRNA慢病毒過表達載體和FHL1 shRNA慢病毒低表達載體,分別以空載體和shRNA-NC為空白對照,侵染A549細胞,侵染方法按照說明書進行,侵染4～6 h后更換新鮮培養液。72 h后于熒光顯微鏡下觀察并拍攝熒光圖片,然后收集細胞,通過RT-PCR及Western blot檢測FHL1基因的過表達情況和不同低表達片段的低表達效率,刷選出FHL1-shRNA穩轉表達細胞株備用。

Western blot方法細胞裂解勻漿液在4 ℃離心(13 000×g,15 min)。離心后吸取上清液轉移至另一個EP管中,BAC法測蛋白濃度。向EP管中按4∶1的比例加變性蛋白上樣緩沖液,95 ℃水浴箱內變性5 min。變性后的樣品在4 ℃保存備用或立即進入下一步實驗。SDS-PAGE法電泳。將漂洗后的膜置于含5%BSA的封閉液中,室溫下搖床輕搖1～2 h。然后TBST液中輕搖洗4次,每次10 min。一抗孵育:將膜按照marker指示帶位置裁剪目標條帶和內參相應條帶,分別置于稀釋好的一抗中,FHL-1抗體稀釋濃度為1∶1 000;β-actin抗體(CST,4967)稀釋濃度1∶4 000。4 ℃孵育過夜。TBST液輕搖洗4次,每次10 min。將膜放于二抗中(IRDye羊抗鼠或羊抗兔抗體,1∶10 000),室溫下搖床輕搖1 h。TBST液輕搖4次,每次10 min。將膜用LI-COR Odyssey系統掃描獲取圖像,用Image J軟件分析目標帶的凈光密度值,內參為β-actin。

CCK-8實驗檢測FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞增殖的影響接種穩轉FHL1低表達和過表達慢病毒載體的A549細胞,分別以穩轉shRNA-NC和空載體的A549細胞為對照,將細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基配成單細胞懸液,以每孔5 000～8 000細胞量接種到96孔板中,每個時間點設6個平行復孔,每孔100 μL,于細胞培養箱(37 ℃,5%CO2)中預培養。

設置時間梯度,分別于固定的培養時間點6、12、24、48、72、96 h 向每孔中加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃細胞培養箱中共孵育1～4 h后終止培養,然后測定各孔450 nm下的吸光度(D450)值。采集數據后,繪制A549細胞的增殖曲線。

流式實驗檢測FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞凋亡和周期的影響常規消化穩轉低表達載體和過表達慢病毒載體的A549細胞,制備懸液,以穩轉shRNA-NC和空載體的A549細胞為對照,計數,接種等量細胞至6孔板中,培養48 h,棄培液,用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁的4組細胞。棄胰蛋白酶,加入2 mL細胞培養液,混勻,轉移到離心管內,300×g離心5 min,棄上清,收集細胞,用預冷的PBS洗滌細胞2次,每次均在300×g、4 ℃離心5 min。收集1～5×105細胞。 加入100 μL 1×緩沖液重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液,輕輕混勻。避光室溫靜置孵育10 min。

加入400 μL 1×緩沖液,混勻,隨即樣品在1 h內用流式細胞儀檢測,分析低表達對細胞的影響。

Transwell實驗檢測FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞遷移的影響所有細胞培養試劑和Transwell小室放在37 ℃溫育;待穩轉過表達載體和低表達慢病毒載體的A549細胞培養至對數生長期,常規消化細胞,用PBS和無血清培養基先后洗滌1次,用無血清培養基重懸細胞,計數,調整濃度為2×105/mL,以穩轉空載體的A549細胞為對照;在下室(即24孔板底部)加入600～800 μL 含10%胎牛血清的培養基,上室加入100～150 μL 上述4種細胞懸液,繼續在溫箱培養24 h;取出小室,吸干上室液體,移到預先加入約800 μL甲醇的孔中,室溫固定30 min;取出小室,吸干上室固定液,移到預先加入約800 μL 0.1%結晶紫染液的孔中,室溫染色15～30 min;用清水沖洗浸泡數次,取出小室,吸去上室液體,用濕棉棒擦去上室底部膜表面上未遷移的細胞;用小鑷子揭下膜,底面朝上晾干,移至載玻片上用中性樹膠封片;于400倍顯微鏡下取5個隨機視野計數,統計結果。

細胞集落形成實驗檢測FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞克隆形成的影響分別取穩轉FHL1過表達和低表達慢病毒載體及空載對照的A549細胞,用胰蛋白酶常規消化,吹打成單細胞懸液,調整細胞懸液密度為1×103個/mL,計數后接種于6孔培養板中,每孔接種1 mL細胞懸液,置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養2周,每48 h更換新鮮培養基,至細胞形成典型集落(多數集落細胞數在50個以上),然后棄去培養基,分別經甲醇固定10 min和0.1%結晶紫染色15 min后,計數集落數,拍照并保存圖像。

統計學方法運用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。實驗結果中,兩組比較采用t檢驗方法,多組比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統計學意義。

結　　　果

慢病毒載體轉染后的細胞株首先，我們利用免疫熒光技術觀察了各組轉染后細胞的形態，FHL1 shRNA低表達組(圖1A)相對FHL1 shRNA空白組(圖1B)細胞數量較多，提示干擾FHL1蛋白表達后可能減少細胞凋亡，進而細胞存活增加。而FHL1過表達組(圖1D)相比FHL1本底表達(空白組)組(圖1C)細胞數量減少，提示過表達FHL1蛋白后可能通過促進細胞凋亡,進而導致細胞數量減少。

FHL1的過表達及低表達的驗證

RT-PCR檢測結果(圖2)我們利用RT-PCR技術驗證病毒轉染的效率,FHL1 shRNA-1、2低表達組FHL1 mRNA表達水平分別為0.015±0.002、0.017±0.003,FHL1 shRNA空白組表達為0.999±0.083,差異具有統計學意義(P<0.000 1),說明兩個干擾病毒轉染后均可以明顯降低FHL1 mRNA水平,干擾病毒作用可靠。FHL1過表達組FHL1 mRNA表達水平為5.330±0.578，明顯高于FHL1空白組(0.545±0.016,P<0.000 1),說明過表達組可以提高FHL1 mRNA水平,病毒效果可靠。

Western blot檢測結果(圖3)利用Western blot技術在蛋白表達水平上檢測了干擾組和過表達組的FHL1蛋白表達，FHL1 shRNA-1、2低表達組相對FHL1 shRNA空白組FHL1蛋白表達顯著減少(圖3A)。FHL1過表達組相比FHL1本底表達(空白組)組FHL1蛋白表達明顯增加(圖3B)。進一步從蛋白表達水平上驗證了干擾與過表達病毒的效率。

A:Imaging of A549 cell in shRNA-NC group;B:Imaging of A549 cell in FHL1-shRNA group;C:Imaging of A549 cell in empty vector group;D:Imaging of A549 cell in FHL1 mRNA group.

圖1慢病毒轉染后的細胞形態
Fig1Cellularmorphologyafterthetransfectionoflentivirusvector

A:FHL1 mRNA expression in groups of shRNA;B:FHL1 mRNA expression in groups of overexpression.(1)P<0.001.

圖2FHL1mRNA表達水平的RT-PCR檢測結果
Fig2RT-PCRtestresultofFHL1mRNAexpression

A:FHL1 protein levels in groups of shRNA;B:FHL1 protein levels in groups of overexpression.

圖3FHL1表達水平的Westernblot檢測結果
Fig3WesternblottestresultofFHL1expression

CCK-8實驗檢測FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞增殖的影響我們利用CCK-8實驗觀察了干擾或過表達FHL1后是否會影響A549細胞的增殖。結果顯示,FHL1 shRNA-1、2低表達組96 h后的平均D值分別為0.291±0.007和0.272±0.005,增殖率分別為103.4%和98.1%,空白組96 h后的平均D值為0.218±0.004,增殖率為65.2%,差異具有統計學意義(圖4A)。該結果表明,干擾FHL1后細胞的增殖較空白組增多。與之相反,FHL1過表達96 h后的平均D值為0.194±0.003,增殖率為43.2%,過表達組細胞的增殖明顯低于空白組,差異具有統計學意義(P=0.002 2,圖4B)。

細胞流式術檢測FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞凋亡的影響為了驗證FHL1影響A549細胞的增殖是否通過影響細胞凋亡而實現的,我們利用流式細胞術觀察了FHL1在過表達和低表達情況下A549細胞的凋亡情況(圖5A～F)。結果顯示,FHL1 shRNA-1、2組的總體凋亡率分別為16.41%和20.12%,低于空白組的26.38% (P=0.004 5、0.032 3)。FHL1過表達組的總體凋亡率為50.48%,高于空白組的25.90% (P=0.003 6),且明顯高于低表達組,差異具有統計學意義(P<0.001,圖5G)。

A:Growth rate of A549 cell in FHL1 low expression groups;B:Growth rate of A549 cell in FHL1 overexpression groups.

圖4FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞增殖的影響
Fig4TheeffectsofFHL1overexpressionandlowexpressiononA549cellgrowth

A-F:Representative graph of apoptosis in different groups;G:Statistics graph of apoptosis in different groups.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖5過表達和低表達FHL1下對A549細胞凋亡的影響
Fig5TheeffectsofFHL1overexpressionandlowexpressiononA549cellapoptosis

Transwell實驗檢測結果為了驗證FHL1干擾或過表達后對A549細胞侵襲能力是否有作用，我們通過 Transwell實驗觀察干擾和過表達FHL1蛋白后對A549細胞侵襲能力的影響(圖6A～E)。結果顯示，FHL1過表達組平均細胞數為58.6±6.4，空白組為122.4±12.8 (P<0.001,圖6G)。而低表達組FHL1 shRNA-1、FHL1 shRNA-2分別為215.6±21.3、200.2±23.7,明顯高于空白組，差異具有統計學意義(P=0.004 8,圖 6F)。

A-E:Low expression of FHL1 on A549 cell proliferation;F-G:Overexpression of FHL1 on A549 cell proliferation.(1)P<0.01,(2)P<0.001.

圖6FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞遷移的影響
Fig6TheeffectsofFHL1overexpressionandlowexpressiononA549cellproliferation

成集落實驗結果每孔接種細胞數103個,將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片,在顯微鏡(低倍鏡)下計數各組大于50個細胞的集落數。FHL1低表達組shRNA-1、shRNA-2的平均集落數分別為157.0±6.4、150.7±9.5,空白組為82.0±7.0,而過表達組的集落數為28.7±6.0,明顯少于空病毒對照組及FHL1低表達組，差異具有統計學意義(P<0.000 1,圖7)。

A-E:Low expression of FHL1 on A549 cell colony formation;F-G:Overexpression of FHL1 on A549 colony formation.(1)P<0.001.

圖7FHL1在過表達和低表達情況下對A549細胞克隆形成的影響
Fig7TheeffectsofFHL1overexpressionandlowexpressiononA549cellcolonyformation

討　　　論

肺癌發生于支氣管黏膜上皮,根據顯微鏡下細胞的大小,肺癌可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)兩大類,其中,后者約占80%～85%,而NSCLC根據細胞類型又分為腺癌、鱗狀細胞癌及大細胞癌等,近年來的流行病學統計顯示,腺癌的發病率明顯增高,在NSCLC中占比超過50%。手術、化療、放療一直以來被作為NSCLC的主要治療手段,但是目前對于進展期NSCLC的治療效果仍然較差,5年生存率僅為16%～20%。而分子靶向藥物的出現,給NSCLC的治療指引了新的方向。近年來,NSCLC分子生物學研究成為熱點,新的腫瘤標志物、治療靶點及有效的腫瘤抑制因子可以為NSCLC的診斷和治療提供更多的手段。

FHL1是FHL家族的一員,在該家族中表達最為廣泛,該家族是一類含有4個半LIM結構域的蛋白家族[1]。研究發現,其成員包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5/ACT,它們表達分布于不同組織中[2]。它們通過活性結構域LIM,與某些結構蛋白、轉錄調控因子、激酶等多種物質產生相互作用,從而對一些基因的表達、細胞的分化發育進行調控[3-4]。FHL1在心、腎、卵巢、肌肉、肺和腦等多種人體正常組織細胞中均有表達[5-6]。研究還發現,FHL1基因缺失可以恢復細胞多態性[7-8],FHL1 在多種人體腫瘤細胞中表達是下降的,可被認為是一種新的腫瘤標志物[9-12]。

本研究通過慢病毒載體轉染肺腺癌細胞株A549,改變腫瘤細胞內FHL1的表達,構建了FHL1高表達和低表達細胞株模型,通過RT-PCR及Western blot檢測均證實其表達差異明顯。CCK-8實驗檢測提示FHL1低表達組的細胞增殖情況明顯高于FHL1高表達組,表明FHL1的表達下調能加快肺腺癌細胞株A549的細胞增殖,而上調FHL1的表達將減緩細胞株的增殖。Niu等[13]的研究中發現FHL1能誘導肺癌細胞周期G1及G2/M停滯,同時下調細胞周期蛋白D1和B1,而上調周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制因子p21,從而對腫瘤細胞的增殖生長產生抑制作用。流式細胞術檢測發現FHL1過表達組的細胞凋亡率明顯高于低表達組及空白對照組,表明FHL1能夠誘導加速肺腺癌細胞的凋亡。研究表明,FHL1以轉錄共調控因子的角色參與細胞增殖分化、轉錄調節、信號轉導、凋亡等多種細胞活動[14-15]。在Transwell實驗中,FHL1過表達組細胞表現出的侵襲性明顯低于低表達組及空白組,表明FHL1對于腫瘤細胞的侵襲性也有影響。在吳成利等[9]、劉哲等[10]及Kashyap等[11]的研究中均發現FHL1的表達與腫瘤的侵襲性呈負相關。細胞集落形成實驗中,FHL1過表達組細胞株在培養基上形成的集落數明顯少于FHL1低表達組,說明FHL1對肺腺癌細胞株的錨定非依賴生長有抑制作用,而錨定非依賴生長是腫瘤發生局部或遠處轉移原因之一[16],因此,FHL1表達對于肺腺癌的轉移亦有影響。細胞的黏著斑對腫瘤細胞的轉移有著重要的影響[17],而Sakashita等[18]研究表明,FHL1在腫瘤中的生物學機制是形成黏著斑。

Niu等[13]的研究中,在體外細胞實驗中發現了FHL1的表達對肺癌細胞的增殖及錨定非依賴性生長有抑制作用,也進一步對其作用機制進行了研究。而本研究的結論與其研究一致,重復驗證了這一現象,但重點主要集中在干擾或過表達FHL1后A549細胞一系列細胞生物學特性的改變,以期更全面地了解FHL1作為肺腺癌腫瘤抑制因子在腫瘤的發生、發展中所起的作用,為深入了解FHL1基因調控A549細胞提供基本的實驗數據。

綜上所述,慢病毒載體轉染肺腺癌細胞株A549能成功構建FHL1過表達及低表達細胞株模型。FHL1對于肺腺癌細胞株A549的增殖、侵襲及轉移均有抑制作用,并且能誘導加速腫瘤細胞凋亡,因此,FHL1作為一種新型的肺腺癌腫瘤抑制因子值得關注。雖然已有動物實驗[13]證實FHL1可抑制裸鼠體內肺癌的生長,但目前FHL1能否作為靶向基因用于人體肺腺癌的治療,尚有待進一步研究。

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