天然水蛭素對肌腱成纖維細胞抑制作用的體外研究

曾林如 湯樣華 王楠

【摘要】 目的：通過體外實驗研究天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞的抑制作用及三種相關細胞因子表達水平的變化，揭示天然水蛭素預防肌腱粘連的作用及相關途徑。方法：體外分離培養(yǎng)兔肌腱成纖維細胞，采取MTT法檢測不同濃度天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞增殖活性的影響；運用ELISA法測定兔肌腱成纖維細胞轉化生長因子β1（TGF-β1）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和基質金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達含量。結果：與未加水蛭素組（0 U/mL）比較，天然水蛭素干預組（1.50、3.00、6.00 U/mL）能夠顯著抑制兔肌腱成纖維細胞生長；并正向調節(jié)bFGF與MMP-2含量表達，負向調節(jié)TGF-β1含量表達（P<0.05或<0.01）。結論：天然水蛭素能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的兔肌腱成纖維細胞的增殖，且具有一定的濃度依賴性；通過降低兔肌腱成纖維細胞TGF-β1的表達并相應提高bFGF與MMP-2的表達可能是其基于TGF-β1/Smads信號通路發(fā)揮抗纖維化作用的一種有效途徑。

【關鍵詞】 水蛭素； 成纖維細胞； 肌腱粘連； TGF-β1； bFGF； MMP-2

【Abstract】 Objective：To reveal the function and pathway of preventing tendon adhesion of hirudin，we investigate the anti-fibrosis effect of hirudin and the expression of three kinds of related cytokines in rabbit tendon fibroblasts in vitro.Method：Firstly，culturing rabbit tendon fibroblasts in vitro，and then observing the morphological changes of each group.Nextly，proliferative activity of fibroblasts was detected by MTT method in different concentrations of hirudin.Finally，the expression levels of transforming growth factor β1（TGF-β1），basic fibroblast growth factor（bFGF） and matrix metalloproteinase 2（MMP-2） in rabbit tendon fibroblasts were determinated by using the method of ELISA.Result：Hirudin intervention group（1.50，3.00，6.00 U/mL） could inhibit the growth of rabbit tendon fibroblasts compared with 0 U/mL group，and increase the expression of MMP-2 and bFGF，while decrease the expression of TGF-β1（P<0.05 or <0.01）.Conclusion：Hirudin can inhibit the proliferative activity of rabbit tendon fibroblasts with concentration dependent in vitro.By increasing the expression of bFGF and MMP-2 and reducing the expressing of TGF-β1 of rabbit tendon fibroblasts may be an effective pathway of anti-fibrosis in hirudin based on TGF-β1/Smads pathway.

【Key words】 Hirudin； Fibroblasts； Tendon adhesion； TGF-β1； bFGF； MMP-2

First-authors address：Xiaoshan TCM Hospital，Hangzhou 311201，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.003

肌腱粘連是外傷后較為常見的并發(fā)癥，甚者會對關節(jié)功能有明顯的影響，近年來已成為臨床迫切需要解決的問題和研究焦點[1-2]。因此，在不影響肌腱本身愈合的同時，如何降低肌腱粘連發(fā)生率，已成為近年研究的焦點[3-5]。研究認為肌腱外源性愈合過程中成纖維細胞的過度增殖是造成肌腱粘連的主要原因[6-8]。其次，與成纖維細胞轉化生長因子β1（TGF-β1）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和基質金屬蛋白酶2（MMP-2）等細胞生長因子密切相關[9-11]。因此，通過抑制腱鞘中成纖維細胞的增殖及相關細胞因子的表達抑制損傷肌腱的外源性愈合以防治外傷后肌腱粘連，成為治療的重要突破點。現(xiàn)代醫(yī)學表明，水蛭素是從水蛭及其唾液腺中分離提取而得的一種小分子蛋白質（多肽），能有效抑制凝血酶誘導的成纖維細胞的增殖，減小凝血酶對內皮細胞的刺激[12-15]。另有研究發(fā)現(xiàn)水蛭素能通過促進bFGF的分泌，抑制TGF-β1分泌，達到抑制成纖維細胞的生長、增殖減輕瘢痕粘連的效果[16]。但至今仍未闡明水蛭素抑制肌腱粘連確切的作用機理和解決術后肌腱粘連的問題。因此，本實驗通過探討天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞因子表達的影響，旨在深入揭示天然水蛭素預防肌腱粘連的作用機制，為臨床推廣中藥及中藥制劑防治肌腱粘連提供理論依據，開辟新的思路及方法。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 普通成年新西蘭大白兔5只，體重3～4 kg，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 天然水蛭素（廣西科康生物科技有限責任公司）；胰酶、Ⅰ型膠原酶（Worthington公司）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Amresco公司）；二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）；TGF-β1、bFGF和MMP-2的ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 主要儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱（CB150型，Binder分司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；電子天平（AB104-S型，Mettler Toledo公司）；電熱恒溫水浴槽（DK-600型，上海醫(yī)療器械五廠）；臺式離心機（800型，上海手術器械廠）；全自動酶標儀（ELX800型，Bio-Tek公司）。

1.1.4 不同濃度天然水蛭素的配置 將天然水蛭素溶于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，配成濃度為100 U/mL的含天然水蛭素培養(yǎng)液，過濾除菌；以其為母液照倍比稀釋法分別配制后續(xù)所需濃度天然水蛭素培養(yǎng)液。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔肌腱成纖維細胞的培養(yǎng) 普通級成年雌性新西蘭兔5只（體重3～4 kg，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供），用氯胺酮肌注麻醉，無菌切取前肢中趾趾深屈肌腱10條，采用組織塊法進行原代培養(yǎng)。用0.05%洗必泰溶液浸泡5 min，生理鹽水漂洗、反復3次，置于0.25%濃度胰酶、4 ℃冷消化處理18 h，然后轉移至培養(yǎng)皿中進行DMEM清洗，并充分剪碎處理，加入0.25%濃度Ⅰ型膠原酶，37 ℃孵育1 h，吸管反復吹打組織塊、分散細胞，消化液100目篩過濾處理，收集濾過的細胞懸液，1 000 r/min離心處理5 min，棄上清；用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將沉淀的細胞團制成細胞懸液；然后行細胞計數，調整至密度為2×105/mL的細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每2～3天換液一次；細胞融合至80%～90%時按常規(guī)方法接種，選用第4～5代細胞。

1.2.2 不同濃度天然水蛭素干預下對兔肌腱成纖維細胞增殖活性的抑制作用 這里需要說明的是水蛭素的單位U。本實驗室是用凝血酶直接滴定法來測定。水蛭素的一個抗凝血酶活力單位U是指在37 ℃下，使一個單位的凝血酶失活所需水蛭素的量。實驗按照水蛭素濃度分為11組：A組（對照組，0 U/mL），B組（1 U/mL），C組（2 U/mL），D組（3 U/mL），E組（4 U/mL），F(xiàn)組（5 U/mL），G組（6 U/mL），H組（7 U/mL），I組（8 U/mL），J組（9 U/mL），K組（10 U/mL），每組6孔。先每孔加入1×104個細胞，37 ℃、5%CO2條件下孵育12 h，細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液。對照組每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液600 μL，其他各組每孔加入含對應濃度的水蛭素DMEM培養(yǎng)液600 μL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后每孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液40 μL，培養(yǎng)4 h后吸去上清液，加入300 μL DMSO，振蕩15 min，使紫色結晶物完全溶解。然后用酶標儀檢測各孔490 nm波長處的吸光度值（OD值）。

1.2.3 不同濃度天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞TGF-β1、MMP-2以及bFGF表達水平的影響 采用雙抗體夾心ELISA法分別檢測每組標本TGF-β1、MMP-2和bFGF的表達含量，操作步驟嚴格依照試劑盒說明實施。用酶標儀在450 nm處測定樣品OD值，根據OD值計算出樣品的濃度。實驗根據水蛭素濃度分為5組：0 U/mL組、0.75 U/mL組、1.50 U/mL組、3.00 U/mL組和6.00 U/mL組，每組6孔。每孔加入1×104個細胞，37 ℃、5%CO2條件下孵育12 h，細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液。對照組每孔加入無血清DMEM培養(yǎng)液100 μL，其他各組每孔加入含對應濃度的天然水蛭素DMEM培養(yǎng)液100 μL。培養(yǎng)48 h后，每孔各加入生物素化的TGF-β1抗體稀釋液、MMP-2抗體稀釋液以及bFGF抗體稀釋液各100 μL，封板膠紙密封處理，培養(yǎng)1小時后洗板5次，最后1次置厚吸水紙上拍干。每孔加入辣氧根過氧化物酶（HRP）100 μL混勻，繼續(xù)避光培養(yǎng)20 min后再次洗板拍干。每孔加入100 μL底物顯色溶液（TMB），混勻后繼續(xù)避光培養(yǎng)20 min。最后每孔加入50 μL終止液，混勻即刻應用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的OD值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用LSD檢驗，P<0.05為顯著差異，P<0.01為明顯顯著差異。

2 結果

2.1 天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞有顯著抑制作用 天然水蛭素濃度為6 U/mL（作用時間48 h）時對兔肌腱成纖維細胞的抑制率可達46.54%，并隨著濃度的增加，作用顯著增強，見圖1。

2.2 不同濃度天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞TGF-β1的表達均具有抑制作用隨著天然水蛭素濃度的增加，成纖維細胞中的TGF-β1的濃度呈下降趨勢。天然水蛭素濃度為6.00 U/mL抑制作用最明顯。當濃度為1.50、3.00、6.00 U/mL時，TGF-β1的濃度均明顯低于0 U/mL組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或<0.01），見圖2和表1。

2.3 不同濃度天然水蛭素對兔肌腱成纖維細胞MMP-2和bFGF的表達均具有促進作用 隨著天然水蛭素濃度的增加，成纖維細胞中的MMP-2和bFGF的濃度均呈現(xiàn)上升趨勢。天然水蛭素濃度為6.00 U/mL時促進作用最明顯。天然水蛭素濃度為1.50、3.00、6.00 U/mL時，MMP-2和bFGF的表達均明顯高于0 U/mL組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或<0.01），見圖3和表2。