洛龍黨參與其他川黨參遺傳多樣性的ISSR分析

楊正久， 代建忠， 梁大敏， 毛朝坤， 董紅梅， 馬增鳳

(1.遵義醫藥高等?？茖W校醫學技術系，貴州遵義 563006； 2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005)

黨參為桔?？泣h參屬植物，川黨參產于四川、貴州、湖南、湖北、陜西等省，歷史悠久，品種較多，已大量人工栽種，不同品種間的性狀與藥用成分含量存在差異。洛龍黨參又名洛黨，產于貴州省道真仡佬族苗族自治縣東北部的洛龍山區而得名，是川黨參的生態變種[1]，以其肉質鮮嫩、藥用價值高而深受外界青睞。黨參主要成分有多糖、黨參苷、甾醇類、生物堿、內酯類、豆素類等，具有益氣生津、補脾養胃的功效，用于脾肺虛弱、氣短心悸、虛喘咳嗽、內熱消渴等病癥[2]。余蘭等研究表明，洛龍黨參的多糖含量達25.6%～27.75%，比其他川黨參高10.97%[3]。

目前分子標記用于黨參種質遺傳多樣性的研究較少，利用簡單重復序列區間(ISSR)分子標記技術對道真洛龍黨參種質資源遺傳多樣性方面的研究還尚未見報道。本研究利用ISSR技術對道真陽溪和壩羊的洛龍黨參與四川、重慶等地其他川黨參的種質遺傳多樣性進行研究，為貴州省遵義市種植黨參品種的鑒定、篩選利用及遺傳改良提供方法和理論依據。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及來源

本研究共采用12個黨參品種(表1)，分別來自貴州省遵義道真縣、重慶、湖北及四川種植黨參種子萌發的嫩葉。選取成熟種子，脫粒去雜，催芽后，置于放有濾紙的培養皿上于 25 ℃ 萌發，發芽3～5 cm高時取幼苗嫩葉，置于-40 ℃冰箱保存備用。

1.2　儀器與試劑

主要儀器：GelDoc XR+凝膠成像系統(BIO-RAD)，Eppendorf Mastercycler?普通PCR儀，Smart SpecTM3000型分光光度計(BIO-RAD)，VE-180型電泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300型電泳儀(上海天能科技有限公司)，TGL-16G 臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。主要試劑：丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、硝酸銀、37%甲醛、四乙基乙二胺(TEMED)、ISSR引物(北京賽百盛基因技術有限公司)。

表1　試驗材料及來源

1.3　黨參基因組DNA的提取

取黨參試驗材料，采用經改進的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取DNA[4-5]，用瓊脂糖凝膠電泳測定其純度，用分光光度計測定其濃度，將提取的DNA稀釋到終濃度 40 ng/μL，用作PCR擴增的模板。

1.4　ISSR引物的篩選和PCR擴增

選用提取的黨參基因組DNA為模板，進行ISSR引物篩選和PCR反應擴增。PCR反應體系為20 μL：模板DNA 1 μL(約30～53 ng)，ISSR引物1 μL(約5 pmol)，PCR mix 18 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取擴增產物5 μL 在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，以0.5×TBE為緩沖液，穩壓150 V，電泳至溴酚藍距凝膠邊緣2～3 cm處結束。采用銀染法進行染色。

1.5　數據處理與分析

ISSR-PCR擴增產物經電泳檢測后，得到電泳圖譜，用Quantity One 6. 0分析軟件結合人工讀帶，按條帶的有無(有記為1，沒有則記為0)記錄電泳條帶，同時將出現頻率超過99%的條帶視為共有帶，出現頻率低于1%的條帶，即被視為沒有條帶而不計入內。將讀出的數據錄入Excel，建立數據庫矩陣。

應用NTsys 2.10e軟件，利用ISSR分子標記數據計算黨參品種間的遺傳相似性系數，采用非加權組平均法(UPGMA)構建黨參品種間的遺傳關系聚類圖；將SM遺傳相似性矩陣進行Dcenter數據轉化，求其特征量和特征向量，生成主坐標二維、三維散點圖。

2　結果與分析

2.1　ISSR引物的篩選及擴增結果

以來自道真陽溪1號和2號黨參基因組DNA作為模板，從100條引物中篩選出10條引物。利用這10條引物能在12個黨參試驗材料中擴增出清晰的條帶，且多態性、穩定性和重復性較好(表2)。

表2　引物篩選及擴增結果

2.2　ISSR-PCR圖譜及多態性分析

本研究從100條引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性好、多態性豐富的10條引物，對12份供試黨參樣品進行ISSR-PCR擴增，共擴增出136個可區分的DNA條帶，平均每條引物擴增出13.6條條帶(表2)。在擴增出的136條DNA條帶中，多態性條帶有114條，多態性條帶占比為83.82%，平均每條引物擴增11.4條多態性條帶。其中引物UBC807和UBC811擴增的條帶數及多態性條帶數較為豐富(圖1)，DNA總條帶數分別為16條和19條，多態性條帶數分別為14條和16條。這表明川黨參種質具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.3　遺傳相似性分析

利用ISSR分子標記數據計算黨參品種間的遺傳相似性系數(表3)。ISSR-PCR擴增結果表明，12個黨參品種之間的遺傳相似性系數均在0.5以上，平均為0.683 6，處于 0.518～0.908之間。其中道真陽溪洛龍黨參品種(1)和四川樂山黨參品種(12)之間的遺傳相似性系數最小，為0.518，二者之間親緣關系最遠；四川樂山(12)和四川雅安(10)之間的遺傳相似性系數最大，表明二者之間的親緣關系最近。道真縣的3個洛龍黨參品種(1、2、3)之間的遺傳相似性系數均較大，在0.775以上，但道真洛龍黨參品種與四川地區的6個品種(7～12)之間的遺傳相似性系數較小，在0.50～0.65之間，表明遵義道真洛龍黨參品種與四川地區黨參品種的親緣關系較遠。

表3　遺傳相似性分析結果

2.4　聚類分析

基于遺傳圖距，應用NTsys 2.10e軟件，對來自道真洛龍、四川、重慶及湖北的12個黨參品種進行UPGMA聚類分析。如圖2所示，12個黨參品種在0.591處分為A、B 2支，來自遵義道真、重慶及湖北的6個黨參品種(1～6)聚為A支，來自四川省的6個黨參品種(7～12)聚為B支，而A支中來自道真洛龍和重慶奉節與巫山的黨參品種又聚為A1支，A1支又分為A11(道真3個品種)和A12(重慶2個品種)2支，來自湖北的黨參品種(6)單獨成1支(A2支)，來自四川的6個黨參品種分為B1和B22支，但遺傳差距很小。結果表明，本研究中的12個黨參種植品種與地理分布有著明顯的相關性，來自同一地區的品種間遺傳差異較小，而不同地區的品種之間的遺傳差異最大。

2.5　主坐標分析

主坐標分析以黨參品種間的遺傳相似性系數矩陣為基礎，不同品種在主坐標圖中的位置能反映它們之間的親緣關系。品種間位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關系越近，反之，則表明遺傳差異越大，親緣關系越遠[6]。產生的主坐標二維、三維散點圖分別見圖3、圖4。不難看出，主坐標分析結果與聚類分析結果一致。來自道真洛龍的3個黨參品種(1～3)遺傳相似性較高，聚集在二維圖的右上角，來自重慶及湖北的3個黨參品種分布在二維圖的右下方；來自四川的6個黨參品種(7～12)遺傳距離較遠，分布在二維圖的左側，由于四川的6個黨參品種間的遺傳差異很小，因此密集地聚集在一起。從三維圖上更能看出品種間的分類很明顯。

3　結論與討論

DNA分子標記技術發展至今已有幾十種，ISSR分子標記技術由于具有成本低、可靠性及穩定性高，試驗操作簡單、快速、高效等優點，被廣泛應用到各類研究中，是理想的分子標記技術[7-8]。利用ISSR分子標記技術研究黨參遺傳多樣性的報道不多，陳大霞等用21條ISSR引物對18份川黨參材料擴增出223個DNA條帶，其中有166個多態性條帶，平均多態率為74.44%[9]；郭宏波從100條ISSR中篩選出13條引物，對來自山西和甘肅2省的150份黨參材料進行分析，擴增出127個清晰的DNA條帶，其中多態性條帶122個，平均多態率為95.77%[10]。以上研究表明，ISSR分子標記技術具有良好的穩定性和準確性，適合用于種質資源遺傳多樣性的分析。

本研究選用洛龍黨參和四川、重慶、湖南各產地種植黨參品種，以黨參的幼苗為材料，對CTAB法進行優化改良，提取黨參基因組DNA。通過優化PCR反應體系，從100條不列顛哥倫比亞大學(UBC)公布的ISSR引物中篩選，以不同產地種植黨參的基因組DNA為模板，用篩選的ISSR引物進行分子標記PCR擴增，用聚丙烯酰胺電泳對產物進行檢測，有利于擴增產物的分辨。本次篩選出的10條ISSR引物對12個黨參品種共擴增出136個清晰的DNA條帶，多態性條帶114條，平均多態性比例為83.82%，最高為92.86%，最低為71.43%。其中引物UBC811擴增出的DNA條帶總數和多態性DNA條帶數最多，分別為19條和16條；而引物UBC835擴增的DNA條帶數最少，只有8條，多態性DNA條帶數6條。ISSR標記DNA圖譜表明，洛龍黨參與其他川黨參具有豐富的基因資源。基因型是遺傳和生態2個因素長期復雜的相互作用的產物，土壤和地理環境對種內變異起重要作用[11]。黨參大面積的種植通常采用種子和種根2種繁殖方式[9]，零星種植也常采用野生種及半野生種的馴化栽培，因此黨參種源復雜，加上道真、四川、重慶及湖北等地不同土壤和地理環境以及氣候與光照的影響，造成了黨參品種具有豐富的遺傳多樣性。

遺傳相似性分析與基于遺傳距離的聚類分析及主坐標分析顯示，12個黨參品種遺傳距離與地理位置分布有著明顯的相關性。四川省的6個黨參品種遺傳距離較遠，形成1支，且品種間的遺傳距離很近，相似性高；道真洛龍黨參與重慶黨參品種遺傳相似性最高，與湖北黨參品種間的遺傳相似性次之，與四川省的黨參品種遺傳相似性最低。張建清等利用隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)技術分析甘肅栽培黨參的遺傳多樣性時，也發現黨參栽培居群的遺傳距離與地理分布呈現一定的相關性[12]，這可能與地域間基因的流動受限有關，也與大面積黨參種植采用種根繁殖有關， 影響了黨參種質的遺傳多樣性。因此，建議在今后的黨參育種過程中，考慮開展不同優良品種中種群間的雜交育種，以獲得更廣泛的遺傳基礎，培育出優良的新品種。

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