雞內源性抗菌肽LEAP-2的生物信息學分析

杭柏林， 徐　軍， 胡建和

(河南科技學院動物科技學院，河南新鄉 453003)

抗菌肽(antimicrobial peptides，簡稱AMPs)是生物機體內具有抗細菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學活性的多肽，是機體先天免疫系統的重要組成部分[1-2]。抗菌肽具有低毒、高效、抗菌譜廣、低耐藥等特點，成為抗生素替代物研究中的佼佼者[3-4]。Krause等從人血液中分離到肝臟表達的抗菌肽LEAP-1、2，其中Ⅱ型肝臟表達抗菌肽(liver-expressed antimicrobial peptide 2，簡稱LEAP-2)有較強的抗微生物活性，但肽的序列、二級結構和表達等方面與其他已知肽類有差異[5]。從雞體內分離到的LEAP-2由76個氨基酸構成，具有抗微生物(如沙門氏菌)的活性[6]。但雞LEAP-2(cLEAP-2)的許多生物信息學內容還不是很清楚。因此，本研究基于cLEAP-2的氨基酸序列利用在線生物軟件和程序進行生物信息學分析，為深入探討其抗菌作用機制提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

雞內源性抗菌肽LEAP-2的氨基酸來自網站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/，登錄號為NP_001001606，其序列為MHCLKIMAFLLFFSLLLSQVYCASLHQPQPLLRLKRMT PFWRGVSLRPVGASCRDNSECITMLCRKNRCFLRTASE。

1.2　方法

1.2.1抗菌肽理化性質分析利用www.expasy.org/tools網站中的ProtParam工具對抗菌肽cLEAP-2進行理化性質參數的分析。

1.2.2抗菌肽的二級結構預測利用https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html網站的二級結構預測工具進行抗菌肽cLEAP-2的二級結構預測。

1.2.3抗菌肽的跨膜區分析利用http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html網站的TMpred網站的工具進行抗菌肽cLEAP-2的跨膜區分析。

1.2.4抗菌肽的信號肽預測利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網站的Signal4.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的信號肽。

1.2.5抗菌肽細胞內定位的預測利用http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/eu_predict.htm網站的亞細胞定位分析工具Sublocal v1.0進行抗菌肽cLEAP-2的細胞內定位預測。

1.2.6抗菌肽糖基化和磷酸化位點預測利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/網站的NetOGlyc 4.0 Server工具和http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網站的NetPhos3.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位點。

1.2.7抗菌肽的三維空間結構分析利用http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1網站的工具進行抗菌肽cLEAP-2三級結構的預測。

1.2.8抗菌肽保守結構域的預測利用http：//smart.embl-heidelberg.de/網站中的工具進行抗菌肽cLEAP-2保守結構域的預測。

1.2.9抗菌肽的抗原表位分析利用DNAStar軟件中的Protean工具進行抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析。

1.2.10抗菌肽的氨基酸序列進化分析在GenBank中檢索到雞和其他42個物種的LEAP-2的氨基酸序列。利用DNAstar軟件中的MegAlign工具，采用Jotun Hein算法進行抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列進化分析。

2　結果與分析

2.1　抗菌肽cLEAP-2的理化性質

雞內源性抗菌肽cLEAP-2分子式為C392H635N113O99S10，有76個氨基酸殘基，由20種基本氨基酸組成，所含的氨基酸殘基數量和含量見表1。cLEAP-2的分子量為 8 835.65 u，等電點為9.86，帶負電的殘基(Asp+Glu)數為3個，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)數為11個。在體外，cLEAP-2 的半衰期在哺乳動物細胞中為30 h，在酵母中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。經軟件計算，不穩定指數為57.27，表明cLEAP-2為不穩定蛋白。總GRAVY值為0.205，表明cLEAP-2為疏水蛋白。

表1　cLEAP-2的氨基酸組成

2.2　抗菌肽cLEAP-2的二級結構

經軟件分析(參數：window width為17，similarity threshold為8，number of states為4)，cLEAP-2的二級結構(圖1)中，α螺旋(36個氨基酸殘基參與)占47.31%，延伸鏈(9個氨基酸殘基參與)占11.84%，β轉角(6個氨基酸殘基參與)占7.89%，無規則卷曲(25個氨基酸殘基參與)占32.89%。

2.3　抗菌肽cLEAP-2的跨膜區預測

經軟件分析(參數：跨膜螺旋長度為17～33aa，得分>500)，cLEAP-2存在跨膜區(圖2)。從里(inside，簡稱i)到外(outside，簡稱o)，可能存在于第6～23位氨基酸殘基之間(得分為2 090)；從外到里，可能存在于第3～21位氨基酸殘基之間(得分為1 748)。

2.4　抗菌肽cLEAP-2的信號肽預測

經軟件分析(Cutoff為0.45)，cLEAP-2存在信號肽(圖3)，位于第1～22位氨基酸殘基之間，得分為0.937。信號肽與成熟肽的剪切位點在第22位和第23位氨基酸殘基之間。

2.5　抗菌肽cLEAP-2的細胞內定位

經軟件分析，cLEAP-2主要定位于細胞核內[可信度指數(reliability index)=4，預期準確率(expected accurcy=91%)]。

2.6　抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位點

經軟件分析，cLEAP-2存在糖基化位點(得分>0.5)，分別是第45、52位的絲氨酸殘基(得分分別為0.746、0.705)。對絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化進行分析，結果見表2，有5個絲氨酸殘基和3個蘇氨酸殘基存在8個磷酸化位點(得分均>0.5)，但沒有酪氨酸的磷酸化位點。推測不同的位點可被不同的激酶引發磷酸化。

表2　cLEAP-2的磷酸化位點預測

注：PKC為蛋白激酶C，PKA為蛋白激酶A，PKG為蛋白激酶G，cdc2為細胞分裂周期蛋白2，cdk5為細胞周期素依賴蛋白激酶5，RSK為核糖體S6激酶，CKⅡ為酪蛋白激酶2，unsp為某種非特異性蛋白激酶(即不在系統中的某種激酶)。

2.7　抗菌肽cLEAP-2的三級結構預測

經軟件分析，cLEAP-2的三級結構見圖4。cLEAP-2的第37～76位氨基酸與SWISS-MODEL TEMPLATE LIBRARY中模板[2L1qA](99.9 ?) HUMAN LIVER EXPRESSED ANTIMICROBIAL的序列相似度為80%，E值為9.02×10-11，預測結果的QMEAN Z值為-1.13。cLEAP-2由α螺旋、延伸鏈、β轉角和無規則卷曲構成，與預測的二級結構結果一致。

2.8　抗菌肽cLEAP-2的功能結構域預測

經軟件分析，cLEAP-2與Pfam數據庫中LEAP-2的結構相似(E值為7.8×10-44)。cLEAP-2的第37～76位氨基酸與PDB：2L1q│A相似(E值為1.0×10-17)，第1～22位氨基酸殘基為信號肽功能結構域，這與前面的預測結果相一致。Low complexity region位于第9～18位氨基酸殘基(圖5)。

2.9　抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析

經軟件分析，由圖6可知cLEAP-2的親水性、表面可及性、柔韌性和抗原性等指數。親水性指數>0、抗原性指數>0、可及性指數>1時，可能存在抗原表位。據此綜合分析，認為cLEAP-2可能存在多個抗原表位。

2.10　抗菌肽cLEAP-2的氨基酸系統進化

將雞內源性抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列與其他42個物種的LEAP-2的氨基酸序列進行系統進化分析，獲得系統樹。由圖7可知，雞(Gallusgallus)內源性抗菌肽cLEAP-2與日本鵪鶉(Coturnixjaponica)LEAP-2的進化關系最近，而與漠林鼠(Neotomalepida)LEAP-2的進化關系最遠。

3　討論

雞內源性抗菌肽LEAP-2是陽離子性抗菌肽[6]。本研究通過在線軟件分析，發現cLEAP-2帶11個正電荷的氨基酸殘基和2個負電荷的氨基酸殘基，分析其總體帶正電荷，認為cLEAP-2是陽離子型抗菌肽。

一般認為，抗菌肽的分子量小，沒有免疫原性[7]，且免疫學中認為分子量在10 000以上的物質有較好的抗原性[8-9]。cLEAP-2由76個氨基酸殘基構成，分子量為8 835.65 u。然而，分子量雖小，但分子結構復雜的物質也具有抗原性[8]。抗原表位可由5～17個氨基酸殘基構成[10]。經DNAStar軟件分析，cLEAP-2可能存在幾個抗原表位。因此，cLEAP-2存在抗原表位可能與其存在三維空間結構有關。但這還需要進一步深入探討。

分析后發現cLEAP-2存在信號肽。這與高榮琨等的研究結果[11]相一致。信號肽可使新合成的多肽分泌到細胞外，從而發揮生理功能[12]。由此推測，cLEAP-2表達后，可到達細胞外發揮抗病原微生物等正常生理活性。同時，分析后發現，cLEAP-2定位于細胞核內，對該定位的生物學作用還有待深入研究。

螺旋結構是抗菌肽發揮抗菌活性的重要結構基礎[13]。經分析，cLEAP-2的二級結構中存在多個α螺旋區及其他結構。可以推測，這些α螺旋可能是cLEAP-2發揮抗菌作用的結構基礎。這一點得到功能結構域預測的佐證。

蛋白的磷酸化和糖基化可以改變蛋白的構象和增加蛋白的穩定性，從而調節蛋白的許多生物學功能[14-15]。經預測發現，cLEAP-2有2個糖基化位點和8個磷酸化位點。同時預測發現cLEAP-2是不穩定的疏水蛋白。因此，糖基化和磷酸化可能使cLEAP-2變得穩定，從而使得cLEAP-2能很好地發揮其功能。

從表11中可以看出：基于K-means算法的評選方法得到的結果都是2015級的班級，這是因為其年級較高，評價班級的相關屬性基本都有取值，而傳統評選方法得到的結果也基本都是較高年級的班級，同時，其存在部分屬性取值較高的、發展失衡的情況。因此，采用基于K-means算法的優秀班集體評選方法，選取不同年級內均衡發展的優秀班集體，比傳統評選方法更合理。

分子進化依賴于核酸和蛋白質的序列信息，是闡明物種間相互關系的分子基礎[16]。通過系統發育樹分析發現，雞源抗菌肽LEAP-2與日本鵪鶉的LEAP-2之間的關系最近，表明抗菌肽LEAP-2在雞和日本鵪鶉中相對保守。

耐藥性或多重耐藥性細菌與真菌的出現使得現有抗菌藥物的療效低下或無效，對人類和動物健康的威脅日趨嚴重[7，17]，尋找新的抗菌物質具有重要意義[18-19]，抗菌肽被認為是理想的抗生素替代物[17]。雞體內的抗菌肽類型主要有β-防御素、cathelicidin和LEAP-2[1]，這幾種抗菌肽在結構和功能上均有差異。目前，對雞抗菌肽LEAP-2的研究還很少。因此，通過生物軟件分析雞抗菌肽LEAP-2的生物信息學內容為深入研究其功能與應用奠定基礎。

4　結論

本研究結果揭示，雞內源性抗菌肽LEAP-2為不穩定的、帶正電荷的疏水性蛋白，有1個跨膜區和1個信號肽，有2個糖基化位點和8個磷酸化位點，二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成，三級結構和功能結構域與人LEAP-2有很高的相似度，存在抗原表位，與日本鵪鶉有非常近的進化關系。

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