人工建立肝臟泡球蚴模型后小鼠的死亡規(guī)律和原因分析

　，，　，　，　，　，示杰

泡球蚴病是多房棘球蚴蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis)感染的人獸共患病，是牧區(qū)常見(jiàn)的嚴(yán)重威脅人畜生命的寄生蟲(chóng)病[1]，我國(guó)多流行于新疆、甘肅、四川西部、青海、寧夏、西藏等地區(qū)。該病多原發(fā)于肝臟，呈惡性侵潤(rùn)性生長(zhǎng)，持續(xù)增生的泡球蚴不斷侵入肝實(shí)質(zhì)、膽管和肝血管，最終導(dǎo)致肝硬化、腹水、膽道梗阻、門靜脈高壓等嚴(yán)重并發(fā)癥[2]，其中有3.3%和4.7%的患者可發(fā)生腦、肺轉(zhuǎn)移[3]，臨床上又稱之為“蟲(chóng)癌”。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者主要使用長(zhǎng)爪沙鼠、子午沙鼠、灰倉(cāng)鼠、昆明小鼠、SD大鼠、豚鼠等進(jìn)行傳代和相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[4-6]，感染泡球蚴的模型鼠陸續(xù)死亡的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題限制著科研工作的進(jìn)展，特別是來(lái)源少、繁殖能力弱的模型鼠大批死亡更造成科研資源的浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)擬探尋肝臟接種泡球蚴的小鼠死亡是否存在規(guī)律，從而進(jìn)一步推測(cè)可能的死亡原因，為有效降低術(shù)后并發(fā)癥，提高生存率提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26 w(周)灰倉(cāng)鼠(泡球蚴腹腔保種16 W)，體重64 g，購(gòu)于新疆烏魯木齊疾病預(yù)防控制中心；10 W昆明小鼠50 只(20-30 g)，購(gòu)于石河子大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2主要材料和儀器PBS液購(gòu)于上海生工生物工程公司，光學(xué)顯微鏡(CX31RBSF)為購(gòu)于日本Olympus公司。

1.3原頭節(jié)懸液的制備采用人工頸椎脫臼法將腹腔感染泡球蚴18 w灰倉(cāng)鼠處死，全身浸泡75%乙醇15 min，消毒解剖臺(tái)，四肢固定，無(wú)菌剖腹，收集腹腔中光滑、成簇并生長(zhǎng)良好及附著于腹壁、腸系膜、隔下、肝臟表面的新鮮泡球蚴組織，放置于盛有PBS液(PBS原液∶雙蒸水=1∶19)的無(wú)菌碗中，依次剪碎，研磨，80 綱目篩網(wǎng)過(guò)篩制成細(xì)小組織勻漿，倒入無(wú)菌離心管并用PBS液反復(fù)清洗，直至下層呈乳白色，上層呈清澈樣分層，搖勻后抽取10 μL混懸液滴至載玻片，0.5%伊紅染色，倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)泡球蚴原頭節(jié)1-3/視野，著色率<15%，計(jì)算出10 μL原頭節(jié)數(shù)目，連續(xù)3 次染色計(jì)數(shù)算取平均值。離心管中加慶大霉素和青霉素注射液各250 U/mL，配制成20%原頭節(jié)懸液。可將未用完剩余的懸液倒致含10%胎牛血清的RPM-1640培養(yǎng)液于37 ℃恒溫箱里保存，并每3～5 d換液1次[7]。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立術(shù)前準(zhǔn)備：①50 只昆明小鼠術(shù)前禁食水8 h，②紫外線消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)、操作間12 h，鼠籠及墊料消毒2 h；手術(shù)簡(jiǎn)要過(guò)程：腹部皮下注射麻醉劑后固定于操作臺(tái)，剃毛，碘伏消毒3遍，無(wú)菌剪于劍突下約0.5 cm處橫向剪開(kāi)0.5 cm切口，直視肝臟穿刺于肝被膜下注射接種0.1 mL原頭節(jié)懸液(約400 個(gè)活原頭節(jié))，逐層關(guān)腹后切口處可撒少量的青霉素粉末；術(shù)后：側(cè)身放入鼠籠內(nèi)，烤燈照射恢復(fù)體溫，24 h后常規(guī)清潔喂養(yǎng)。

1.5動(dòng)態(tài)觀察生理變化及尸檢術(shù)后動(dòng)態(tài)觀察小鼠生理變化15 d，術(shù)后72 h內(nèi)每隔3 h觀察小鼠一次，術(shù)后3 d到15 d每6 h觀察小鼠一次，并記錄體征變化。發(fā)現(xiàn)小鼠死亡即刻行尸體解剖，詳細(xì)觀察手術(shù)切口、肝臟穿刺點(diǎn)、腹膜的特點(diǎn)，分析可能的死亡原因。判斷方法和分類：①術(shù)后未蘇醒或蘇醒中肢體蜷縮、寒戰(zhàn)、無(wú)法站立征象，隨后24 h內(nèi)死亡，尸體解剖發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)含大量新鮮血液，可判定為術(shù)中肝臟出血量較大誘導(dǎo)失血性休克所致；②術(shù)后未蘇醒或蘇醒后精神萎靡、步履爬行征象，尸體解剖未發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)含大量新鮮血液，判定為麻醉劑量過(guò)大或麻醉藥物的毒副作用所致；③術(shù)后3 d后相繼出現(xiàn)眼神恍惚、行走搖擺、寒戰(zhàn)、四肢蜷縮征象，尸檢發(fā)現(xiàn)手術(shù)切口處有黃綠色膿液流出，腹膜散在白色斑點(diǎn)，判定為切口及腹膜感染所致；④術(shù)后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)噴嚏、瘙癢、豎毛反應(yīng)，隨后出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呼吸急促、四肢抽搐等征象，尸檢發(fā)現(xiàn)肝臟接種處呈白色絮狀，判定為泡球蚴的抗原性致過(guò)敏性炎癥反應(yīng)；⑤尸檢發(fā)現(xiàn)肝表面呈暗紅色，有散在出血點(diǎn)，判定為重度肝損傷所致。

2　結(jié)　果

術(shù)后15 d，50 只接種泡球蚴的小鼠陸續(xù)死亡19只(圖1)，死亡率為38%，除術(shù)后第9 d死亡1 只小鼠外，其余均死于術(shù)后7 d之內(nèi)，死亡率為36%，與本課題組原先造模存活率大致相當(dāng)。術(shù)后第1、2 d各死亡2 只，而后死亡數(shù)量開(kāi)始上升，第4～5 d持續(xù)兩天最高峰，隨后急劇下降，第3～5 d為術(shù)后小鼠的死亡高峰期，占總死亡量的57.8%，也是術(shù)后各種并發(fā)癥的高發(fā)期(圖2)。

圖1　手術(shù)后每日死亡量和時(shí)間的關(guān)系Fig.1　The relationship between daily death volume and time after surgery

圖2　術(shù)后7 d內(nèi)每日死亡量的變化Fig.2　Changes in daily death volume within 7 days after surgery

動(dòng)態(tài)觀察小鼠生理變化及尸檢可推斷因術(shù)式或操作死亡1 只(占總死亡數(shù)的5.2%)，麻醉死亡2 只(占總死亡數(shù)的10.4%)，感染死亡7 只(占總死亡數(shù)的36.8%)，泡球蚴抗原性死亡4 只(占總死亡數(shù)的21.5%)，肝損傷3 只(占總死亡數(shù)的36.8%)，其余原因死亡2 只(占總死亡數(shù)的10.4%)。感染死亡比例最大，其次為泡球蚴的抗原性死亡，兩者共占總死亡量的58.3%，說(shuō)明此兩種情況導(dǎo)致的并發(fā)癥是導(dǎo)致小鼠死亡的主要因素。

3　討　論

肝膽解剖系統(tǒng)和生理功能的復(fù)雜性及特殊性是術(shù)后并發(fā)癥高發(fā)的主要原因，黃莚庭[8]分析肝膽外科的術(shù)后并發(fā)癥主要與肝膽系統(tǒng)的病況、術(shù)式、手術(shù)技術(shù)、圍手術(shù)期的管理不當(dāng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)接種泡球蚴的小鼠術(shù)前均為健康體質(zhì)，無(wú)肝膽系統(tǒng)疾病。現(xiàn)將對(duì)可能致術(shù)后小鼠死亡的并發(fā)癥進(jìn)行深入討論與分析。

3.1術(shù)式與技術(shù)現(xiàn)階段肝臟接種泡球蚴的術(shù)式主要有開(kāi)腹直視肝臟穿刺接種術(shù)、B超引導(dǎo)下或直視經(jīng)皮肝穿刺接種術(shù)、腹腔穿刺接種術(shù)、門靜脈側(cè)支血管穿刺接種術(shù)、經(jīng)肝門靜脈穿刺接種術(shù)。張明星[9]實(shí)驗(yàn)研究表明B超引導(dǎo)下的經(jīng)皮肝穿刺有操作簡(jiǎn)單，術(shù)后反應(yīng)較弱的特點(diǎn)，泡球蚴感染率約60%。但本實(shí)驗(yàn)室暫無(wú)B超儀器和掌握B超儀器操作的人員，而直接經(jīng)皮肝穿刺接種可能會(huì)因操作者水平等原因?qū)е赂闻K出血、原頭節(jié)懸液外漏、刺破膽囊、胸腔、消化道等，從而減低模型生存率。主要寄生于腹腔及盆腔的腹腔穿刺用于接種大鼠和沙鼠肝臟感染率為22%和77.3%[10]，此數(shù)據(jù)無(wú)法清楚的反應(yīng)出原發(fā)性肝臟病灶的生長(zhǎng)狀況，現(xiàn)普遍作為傳代保種的常規(guī)術(shù)式。門靜脈側(cè)支血管穿刺接種術(shù)模擬自然感染途徑，張金輝實(shí)驗(yàn)中大鼠和沙鼠的肝臟感染率僅為6.3%和38.5%，極低的感染率無(wú)法保證模型接種的成功性，此方法已逐漸被淘汰；溫浩[11]發(fā)明的經(jīng)門靜脈穿刺接種是接近自然感染途徑和較高感染率的新型術(shù)式，由于本課題組以前尚未使用過(guò)此術(shù)式，預(yù)實(shí)驗(yàn)中此方法的存活率僅有33.3%(3/9)。開(kāi)腹直視肝臟穿刺接種術(shù)的感染率可達(dá)90.9%[10]，此術(shù)式本課題組連續(xù)使用多年，操作者有相對(duì)成熟的技術(shù)，本次實(shí)驗(yàn)全部采用開(kāi)腹直視肝臟穿刺法接種，該術(shù)式對(duì)手術(shù)環(huán)境條件、圍手術(shù)期的工作、手術(shù)操作的規(guī)范性要求較高，落后的實(shí)驗(yàn)室條件、淡薄的無(wú)菌意識(shí)和粗暴的操作、較長(zhǎng)的切口均可增加并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)率。操作者對(duì)肝臟解剖知識(shí)掌握的局限性和術(shù)中操作的失誤是導(dǎo)致模型的死亡的重要原因之一，術(shù)中操作者過(guò)度牽拉肝臟導(dǎo)致較大血管破裂、刺破消化道、膽漏、胸腔均直接導(dǎo)致小鼠術(shù)中死亡。術(shù)后第1 d死亡的1 只小鼠在蘇醒中有肢體蜷縮、口唇發(fā)紺、步履爬行征象，尸檢發(fā)現(xiàn)腹腔及肝臟表面有大量新鮮血液，不排除術(shù)中損傷較大肝血管的可能。

3.2麻醉藥物與劑量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉方法、劑量以及維持效果時(shí)間和蘇醒時(shí)間把握的準(zhǔn)確性關(guān)乎實(shí)驗(yàn)整體過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室常用麻醉劑有乙醚、異氟烷、巴比妥鹽酸類(戊巴比妥鈉、硫噴妥鈉等)、卡因類(利多卡因、普魯卡因等)、氯胺酮等。本次使用自行配置10%水合氯醛(注射量 0.3 mL/100 g)下腹部皮下注射麻醉，效果不明顯后逐次追加注射0.05 mL。水合氯醛是具有通透性臭氣和腐蝕性苦味的無(wú)色透明晶體狀物質(zhì)[12]，一般使用濃度為10%，使用劑量為300 mg/kg，麻醉持續(xù)時(shí)間約2 h。作為目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)麻醉劑之一，不但有較好的效果和較高的安全性[13]，還具有麻醉誘導(dǎo)和術(shù)后蘇醒較快、死亡率低、來(lái)源廣泛等優(yōu)點(diǎn)[14]。根據(jù)注射劑量不同，水合氯醛分別有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、昏迷和麻醉作用，作用機(jī)制主要是抑制網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)[15]。循環(huán)系統(tǒng)中，大劑量的水合氯醛可抑制心肌收縮和引起心律失常，小劑量無(wú)明顯毒性作用[12]；神經(jīng)系統(tǒng)中，相比其他常規(guī)麻醉藥物，可較長(zhǎng)時(shí)間腦室保持低溫狀態(tài)，同時(shí)吸收后的水合氯醛可被肝臟及其余組織還原成三氯乙醇，后者有中樞抑制作用，輕者可出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、抽搐、意識(shí)障礙等征象，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生呼吸麻痹、循環(huán)衰竭；呼吸系統(tǒng)中，高濃度的水合氯醛可促使小鼠口腔分泌物增多，阻礙正常呼吸運(yùn)動(dòng)[14]，因此蘇醒過(guò)程中可能出現(xiàn)蜷縮、不愿攀爬現(xiàn)象。術(shù)后3 h觀察，幾乎所有小鼠均出現(xiàn)呼吸頻率升高，胸、腹式混合方式呼吸的征象，個(gè)別出現(xiàn)抽搐、不可自行翻正、角弓反張癥狀，鉗夾腳趾未引起回縮反射現(xiàn)象。術(shù)后6 h觀察發(fā)現(xiàn)除1 只小鼠在蘇醒中出血抽搐、精神萎靡、意識(shí)不清外，其余小鼠均可自行翻身和緩慢爬行，尸檢發(fā)現(xiàn)腹腔及肝臟表面未見(jiàn)出血點(diǎn)。第1 d死亡的2 只小鼠中的1 只除前面已分析的操作不當(dāng)引起之外，未蘇醒小鼠的死亡可能是由過(guò)量麻醉劑抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)所引起，1只蘇醒后又于24 h內(nèi)死亡的小鼠可能是由于水合氯醛致口腔分泌物增多而阻塞呼吸道導(dǎo)致。

3.3感染本實(shí)驗(yàn)在造模過(guò)程中采取以下措施防止出現(xiàn)因感染所致的大量死亡現(xiàn)象：①紫外線滅菌封閉操作室和無(wú)菌操作臺(tái)12 h，換用干凈鼠籠和墊料并紫外線滅菌2 h；②術(shù)前禁食水8 h，排空胃腸內(nèi)容物，防止胃內(nèi)容物反流致氣管而導(dǎo)致氣管阻塞、肺部感染及降低腸道菌群失調(diào)而致的腹腔感染機(jī)率；③操作者進(jìn)入操作間時(shí)常規(guī)噴灑95%酒精簡(jiǎn)易消毒，手術(shù)器械均高溫滅菌后使用；④麻醉倉(cāng)鼠后于75%乙醇內(nèi)浸泡15 min，開(kāi)腹前胸部、腹部剔剪毛發(fā)，醫(yī)用碘伏消毒3 遍；⑤置取原頭節(jié)懸液后加入青霉素和慶大霉素注射液各250 U/mL；⑥關(guān)腹時(shí)于手術(shù)切口處撒下少量青霉素粉末。根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作流程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，感染可由以下幾種情況所致：①術(shù)后的應(yīng)激狀態(tài)可使腸粘膜屏障功能損傷，大量腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)，而內(nèi)毒素又增加腸粘膜通透性和促腸道正常菌群的移位，同時(shí)損害機(jī)體免疫功能[16]。而術(shù)后短期內(nèi)肝功能的下降使進(jìn)入門靜脈的腸道菌群及內(nèi)毒素?zé)o法在短時(shí)期內(nèi)完全清除而進(jìn)入體循環(huán)，從而誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒血癥的發(fā)生[17]，后者常伴有感染性休克，造成微血管循環(huán)障礙、毛細(xì)血管通透性增高，小鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、萎靡不振、軀體蜷縮等現(xiàn)象，誘發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)，最終死于多系統(tǒng)器官衰竭(MOSF)，Sumpio[18]研究證實(shí)內(nèi)毒素的增敏效應(yīng)也是機(jī)體發(fā)生MODS的重要過(guò)程；②關(guān)腹后未對(duì)手術(shù)切口包扎處理及未定期對(duì)切口處消毒換藥，切口完全暴露于空氣中，小鼠對(duì)傷口的爪撓極大增加手術(shù)切口感染的風(fēng)險(xiǎn)，小鼠平躺或側(cè)躺時(shí)切口膿液反流至腹腔可誘發(fā)腹腔感染及急性腹膜炎發(fā)生；③根據(jù)李金寶等[17]的促炎/抗炎平衡失衡理論，當(dāng)促炎反應(yīng)的作用大于抗炎反應(yīng)時(shí)，機(jī)體對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)過(guò)于強(qiáng)烈使自身細(xì)胞損傷增強(qiáng)，此機(jī)制極易誘發(fā)MODS，當(dāng)抗炎反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的“免疫麻痹”使對(duì)外來(lái)刺激的反應(yīng)遲鈍，增強(qiáng)感染機(jī)率并使現(xiàn)有的炎癥無(wú)法控制，最后可導(dǎo)致膿毒血癥及MOSF。術(shù)后對(duì)小鼠不定時(shí)的觀察發(fā)現(xiàn)：第3 d后數(shù)只造模小鼠相繼出現(xiàn)嗜睡狀態(tài)、少動(dòng)、痛覺(jué)遲鈍、厭食、呼吸加快癥狀，隨后出現(xiàn)寒戰(zhàn)、精神萎靡，最后死亡。19 只小鼠尸檢中發(fā)現(xiàn)有5 只手術(shù)切口處可見(jiàn)青綠色液體，并伴有惡臭，解剖腹腔發(fā)現(xiàn)中有7 只小鼠(包括切口處有膿液的5 只)腹膜上有白色斑點(diǎn)狀液體。根據(jù)以上分析可推測(cè)造模小鼠的直接死亡原因可能是急性腹膜炎或膿毒血癥導(dǎo)致的MOSF，而手術(shù)切口感染或腹腔感染是死亡的主要間接原因。

3.4泡球蚴的抗原性本次實(shí)驗(yàn)使用1 mL注射器于肝被膜下接種0.1 mL 20%的原頭節(jié)懸液(約400-500 個(gè)活的原頭節(jié))。泡球蚴的抗原性可誘發(fā)機(jī)體迅速產(chǎn)生非特異性免疫和特異性免疫，其中短時(shí)間強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致致命的過(guò)敏性休克。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者們對(duì)泡球蚴免疫發(fā)病機(jī)制的進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)泡球蚴在體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)受到血液及組織中嗜酸性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)等的非特異性免疫抵抗。吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO可直接或者間接殺死原頭節(jié)[19]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)感染泡球蚴患者血清中NK細(xì)胞的活性和比率明顯較正常組低，由此推斷感染者血液中可能存在一種由泡球蚴的抗原性產(chǎn)生，并抑制NK細(xì)胞發(fā)揮免疫機(jī)制或者直接殺死NK細(xì)胞的物質(zhì)[20-21]。體液免疫的研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴患者的血清存在IgG、IgA、IgE和IgM特異性抗體。感染泡球蚴的小鼠IgE水平逐漸增加表明I型速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)在體液免疫中起主導(dǎo)作用，受IL-4和IL-5刺激的IgE還參與泡球蚴囊泡周圍肉芽腫的形成[22]。包蟲(chóng)早期感染指標(biāo)IgM也可作為評(píng)價(jià)手術(shù)質(zhì)量的重要指標(biāo)[23]。泡球蚴蛋白抗原以各種形式與巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞(樹(shù)突狀細(xì)胞)等表面的抗原決定簇結(jié)合后被吞噬到細(xì)胞內(nèi)，DC細(xì)胞快速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，同時(shí)變成成熟DC細(xì)胞，后者激發(fā)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[24]。受到泡球蚴刺激的初始T細(xì)胞活化為效應(yīng)T細(xì)胞，其中Th1細(xì)胞分泌的IL-2和IFN-γ增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，而Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10促進(jìn)體液免疫，兩者相關(guān)拮抗。感染泡球蚴的小鼠前8周細(xì)胞免疫主要以CD4+為主導(dǎo)，大量CD4+細(xì)胞在原頭節(jié)周圍聚集成肉芽腫的形式，呈保護(hù)性免疫狀態(tài)，隨后CD8+細(xì)胞水平上升使機(jī)體形成有利于泡球蚴體內(nèi)繁殖的免疫抑制狀態(tài)[25-26]。術(shù)后1 h內(nèi)數(shù)只小鼠出現(xiàn)抓鼻撓嘴、噴嚏、精神萎靡、四肢抽搐等過(guò)敏反應(yīng)癥狀，尸檢發(fā)現(xiàn)1 只小鼠口角有新鮮血液，考慮為過(guò)敏所致的肺水腫及肺淤血，另有3 只小鼠肝臟接種處有白色絮狀斑點(diǎn)，考慮為炎癥反應(yīng)帶。小鼠在感染泡球蚴后，體內(nèi)非特異性免疫、特異性細(xì)胞免疫和特異性體液免疫相互作用導(dǎo)致各器官的嚴(yán)重?fù)p傷可能是小鼠術(shù)后死亡的直接原因之一，另外嚴(yán)重的過(guò)敏性休克所致的心血管及呼吸系統(tǒng)的損傷可加速小鼠死亡。

3.5肝損傷肝臟損傷是各種泡球蚴接種術(shù)式中最常見(jiàn)的并發(fā)癥，術(shù)中肝破裂可致失血性休克和急性肝衰竭，另外炎癥所致的肝臟細(xì)胞壞死也可造成肝臟損傷，兩種方式極大提高造模死亡率。以下具體分析肝損傷的原因：①操作者技術(shù)不嫻熟、不正規(guī)或?qū)τ诟闻K解剖結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)不到位、術(shù)中穿刺部位過(guò)深、多次穿刺均可造成嚴(yán)重?fù)p傷肝臟，另外肝內(nèi)膽管的破裂使膽汁外漏而腐蝕正常肝臟組織；②原頭節(jié)作為外原性抗原可使接種泡球蚴的病灶周圍形成炎性反應(yīng)帶，炎性反應(yīng)的蔓延可在短時(shí)間內(nèi)造成大量正常肝細(xì)胞的損傷變性和死亡，隨著肝細(xì)胞正常代謝工作的減退與停止，有毒物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)大量堆積，隨著時(shí)間延長(zhǎng)還可形成彌漫性肝纖維化和散在的鈣化灶。以上原因?qū)е碌母螕p傷和肝功能障礙最后可演化成急性肝臟衰竭和肝昏迷，這可能是術(shù)后小鼠死亡的原因之一。尸檢中發(fā)現(xiàn)3 只小鼠的肝臟表面呈暗紅色，有散在出血點(diǎn)，證實(shí)可能死于肝損傷所致的急性肝功能衰竭。

綜上所述，小鼠在泡球蚴接種后的死亡主要與各種并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)，其中與手術(shù)方式、麻醉、感染、泡球蚴的抗原性、肝損傷等密切相關(guān)，另外還可能與消化道出血、腹腔積液、膽漏、急性腎臟衰竭有關(guān)。對(duì)各種并發(fā)癥的發(fā)生需操作者提高警惕，但因各種條件有限，對(duì)并發(fā)癥的處理還需進(jìn)一步研究。

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