夾心ELISA檢測微小隱孢子蟲抗原方法的建立及初步應用

　，，，，龍現，，

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的人獸共患腸道原蟲，其宿主范圍十分廣泛，可感染包括人類在內的哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類等多種脊椎動物[1]。隱孢子蟲多通過受污染的水源和食物等途徑傳播，由其感染可導致以腹瀉為主要臨床癥狀的人獸共患原蟲病[2]。免疫功能健全的宿主感染本蟲后，一般表現為自限性的短期急性腹瀉；而免疫力低下、免疫功能缺陷或抑制者則通常表現為持久的水樣腹瀉，導致體液大量丟失而危及生命。該病已被確認為引起人腹瀉的六大病因之一，并被世界衛生組織(WHO)和美國疾病預防控制中心(CDC)列入新發傳染病[3-4]。隱孢子蟲病的病原檢測有形態學、免疫學和分子生物學等方法，最常用的是檢測糞便樣品中的隱孢子蟲卵囊[5]。糞便學檢測主要有染色法、漂浮法和沉淀法，這些方法具有操作簡單、費用低等優點，但是常規糞檢有敏感性低、漏檢率高等缺點[6-7]且需要檢測人員有一定的檢測經驗。免疫學檢測方法主要有免疫熒光、免疫印跡、免疫磁珠分離、流式細胞儀和間接血凝試驗等，因特異性高、敏感性強，便于批量檢測等優點，被廣泛應用于隱孢子蟲病診斷中[8]。

本研究以兔抗微小隱孢子蟲血清抗體(IgG)為捕獲抗體，以雞抗微小隱孢子蟲卵黃抗體(IgY)為檢測抗體，建立了雙抗體夾心ELISA方法并進行初步應用，以期為微小隱孢子蟲病的流行病學調查和診斷提供快速、簡便的免疫學檢測方法。

1　材料與方法

1.1樣品及試驗用抗體來源微小隱孢子蟲卵囊由人工感染犢牛后純化獲得；抗微小隱孢子蟲IgG抗體、IgY抗體由本實驗室制備。

1.2儀器及試劑超聲波細胞粉碎儀：Cole.Parmer Instrument公司；紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；漩渦振蕩器：Scientific Industries INC；全自動酶標儀：Thermo公司；HRP-兔抗雞IgY：上海艾博抗貿易有限公司；透析袋：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Cryptosporidiumparvum Antigen Test Kit(P00605-1): IDEXX公司。

1.3抗原的制備將提純后卵囊(108/mL)置液氮(-196 ℃)和水浴鍋37 ℃反復凍融5次，超聲波細胞粉碎儀(100HZ)2 min×5次破碎后，10 000 r/min離心15 min，上清測定蛋白含量后作為檢測用抗原[25]。

1.4IgG和IgY的純化采集的血清抗體IgG參照文獻[9]采用鹽析法純化血清抗體，純化后-20 ℃保存備用；參照文獻[10-11]采用水稀釋二步硫酸銨的方法純化IgY抗體，純化后-20 ℃保存備用。

1.5夾心ELISA方法的工作流程以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋IgG后包被96孔酶標板，100 μL/孔，同時設立陰性對照和空白對照各4個重復；每孔加200 μL封閉液，反應后同上洗滌；將待檢抗原按最佳稀釋倍數稀釋，100 μL/孔，37 ℃反應1 h后同上洗滌；將IgY稀釋至最佳工作濃度，100 μL/孔，37 ℃反應1 h后同上洗滌；加HRP標記的羊抗雞IgG抗體，100 μL/孔，37 ℃反應1 h后同上洗滌；加新鮮配制的底物溶液，100 μL/孔，室溫避光；加入終止液，每孔50 μL；酶標儀讀取OD450nm值。

1.6雙抗體夾心ELISA最優條件的確定

1.6.1捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度的測定

采用方陣滴定法確定IgG最適包被濃度和檢測抗體IgY的最佳工作濃度。將純化的IgG稀釋為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600和1∶3 200等6個濃度進行包被，每個濃度重復4孔，4 ℃包被過夜。用1%明膠進行封閉，IgY也分別做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600和1∶3 200等6個濃度稀釋，每個稀釋度重復4孔，37 ℃孵育1 h。按照1.4夾心ELISA方法進行操作，記錄結果。選取相鄰平均OD450nm值出現較大變化并且P/N值達到最大的孔，確定捕獲抗體最適包被濃度和檢測抗體最佳稀釋度。

1.6.2最佳包被條件的確定將包被抗體IgG進行1∶800稀釋后包被酶標板，分別在以下3個條件下包被：37 ℃作用1 h后4 ℃過夜，37 ℃作用2 h后4 ℃過夜，4 ℃過夜，篩選最優包被條件。

1.6.3抗原最佳濃度的確定將試驗用抗原分別稀釋為3 μg/mL、2.5 μg/mL、2 μg/mL、1.5 μg/mL和1 μg/mL共5個濃度每個稀釋度重復4孔，每孔100 μL，37 ℃作用1 h后4 ℃過夜，用1%明膠進行封閉1 h，37 ℃孵育1 h。按照1.4夾心ELISA方法進行操作，記錄結果，確定抗原最佳稀釋度。

1.6.4最佳(檢測抗體)IgY作用時間將檢測抗體作用時間依次調整為15min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和120 min，確定最佳抗體作用時間。

1.6.5最佳酶標抗體工作濃度的確定96孔酶標板包被、封閉之后，其它條件按上述的最佳條件進行，對酶標抗體進行1 000、3 000、5 000、8 000和10 000倍稀釋，確定最佳稀釋倍數。

1.6.6最佳酶標抗體作用時間的確定96孔酶標板包被、封閉之后，檢測抗體時間、最佳稀釋度，酶標抗體最佳濃度按上述的最佳條件進行，將酶標抗體作用時間依次調整為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min和120 min，確定最佳作用時間。

1.6.7最佳顯色時間的確定96孔酶標板包被、封閉之后，其它條件按上述的最佳條件進行。加底物液后，分別避光顯色5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，確定最佳顯色時間。

1.7夾心ELISA方法的評價

1.7.1重復性試驗以批內和批間重復性試驗來檢驗夾心ELISA方法的重復性，選取3份卵黃抗體樣本在不同時間、相同條件下重復做夾心ELISA測定，每個樣品重復3次，計算同一份樣本OD450nm值的變異系數(CV)，比較試驗結果。

1.7.2特異性試驗采用優化后的夾心ELISA方法同步檢測球蟲卵囊、圓線蟲和蛔蟲蟲卵，檢驗該方法的特異性。

1.7.3敏感性試驗將隱孢子蟲卵囊抗原從5×105個/mL開始做2倍連續稀釋至7.5×103個/mL，共做7個稀釋度，其他條件不變，按照已建立的夾心ELISA操作方法測定OD450nm值，檢測其靈敏度。以出現陽性的最高稀釋倍數推算出其最小檢出量。

1.8與隱孢子檢測商品化試劑盒檢測效果比較按照1.7的方法，用購于愛德士公司的隱孢子蟲檢測試劑盒檢測。分別從特異性、重復性、敏感性、經濟實用性和耗時等與本試驗建立的方法作比較。

1.93種前處理方法檢測效果比較從長春某養殖場采集豬的糞便樣品，共108份(鏡檢均為隱孢子蟲陰性)。取每份糞樣5～10 g,加適量自來水,攪拌均勻,用銅篩進行過濾，濾液置離心管中以3 000 r/min離心10 min，棄去上清。上述處理好的糞便樣品分四組(分別為1、2、3、4)，每組27份并進行人工植入隱孢子蟲卵囊，每組分別按照10萬，5萬，2.5萬…到5個卵囊/mL和104、103…10-1個卵囊/mL兩種方式植入卵囊。

第1組用飽和食鹽水漂浮法處理，第2組用飽和蔗糖溶液漂浮法，第3組用洗滌劑PBST洗滌處理，第4組不再進行處理直接提取DNA，基于18S擴PCR，電泳檢測擴增效果。

2　結　果

2.1抗原蛋白含量的測定紫外分光光度計測得試驗用抗原蛋白含量為1.734 mg/mL。

2.2夾心ELISA方法的建立判定標準：選取陽性卵黃相鄰OD450nm值出現較大變化且P/N值達到最大的孔作為最佳條件的選擇。

2.2.1捕獲抗體和檢測抗體最佳工作濃度的測定方陣滴定結果可知(表1)，捕獲抗體IgG包被濃度為1∶800，檢測抗體IgY稀釋度為1∶100時，OD450nm接近于1.0，且此時P/N最大，故在ELISA檢測方法中IgG包被濃度為1∶800，被檢樣品的最佳稀釋倍數為1∶100。

2.2.2抗原最佳濃度的確定由圖1可知，抗原最佳稀釋濃度為2.5 μg/mL。

2.2.3最佳包被條件的確定最佳包被條件的選擇結果如表2所示。試驗確定最佳包被條件為37 ℃孵育1 h后4 ℃過夜。

圖1　抗原佳稀釋度的確定Fig.1　Selection of the optional working concentration of antigen

2.2.4檢測抗體IgY最佳作用時間最佳檢測抗體作用時間選擇結果如圖2所示。試驗確定最佳檢測抗體作用時間為37 ℃孵育30 min。

表1血清最適包被濃度及陰、陽性IgY最佳稀釋度的確定
Tab.1Selection of the optional working concentration of coated antigen，negative and positive IgY

陰、陽性IgY稀釋倍數TheoptimizationdilutionofnegativeandpositiveIgY陰、陽性血清稀釋倍數Theoptionalworkingconcentrationofserum10020040080016003200100(+)1．4151．2891．1661．1170．7000．515100(-)0．2730．2700．2250．2130．2030．197P/N5．1804．7705．1805．2403．4502．610200(+)0．8720．8530．7750．7730．4790．375200(-)0．1600．1570．1520．1400．1250．117P/N5．0655．4305．1005．5203．8303．210400(+)0．7050．6740．6620．5820．3680．304400(-)0．1970．1690．1660．1580．1560．145P/N3．5803．9903．9803．6802．3602．100800(+)0．4170．3520．3330．3110．1920．176800(-)0．1250．1250．1070．1030．0970．096P/N3．3402．8163．1103．2001．9801．8101600(+)0．2280．2060．1860．1550．1180．1061600(-)0．0710．0710．0660．0640．0580．057P/N3．2102．9002．8202．4202．0301．860

表2最佳包被條件的確定
Tab.2Selection of optimal coating condition

包被條件陽性IgYOD450nm陰性IgYOD450nmP/N37℃作用1h后4℃過夜1．0000．1327．5837℃作用2h后4℃過夜0．8950．1306．884℃過夜0．8050．1804．4737℃作用10h0．6770．2492．72

圖2　IgY最佳反應時間的的確Fig.2　Selection of optimal reaction time of IgY

2.2.5最佳酶標抗體工作濃度的確定最佳酶標抗體工作濃度的選擇結果如圖3，因此確定最佳酶標抗體工作濃度為1∶5 000稀釋。

圖3　最佳酶標抗體工作濃度的選擇Fig.3　Optimination of anti-body dilution

2.2.6酶標抗體最佳作用時間最佳酶標抗體作用時間選擇結果如圖4所示。試驗確定最佳酶標抗體作用時間為37 ℃孵育45 min。

圖4　酶標抗體最佳反應時間的的確定Fig.4　Selection of optimal reaction time of enzyme labeled antibody

2.2.7最佳顯色時間的確定最佳顯色時間的選擇如圖5所示，試驗確定最終顯色時間為室溫顯色10 min。

圖5　最佳顯色時間的確定Fig.5　Determination of substrate reaction time

2.2.8最佳終止條件的確定最佳終止條件的選擇如表3所示，試驗確定最終終止條件為2 mol/LH2SO4，每孔加入50 μL。

表3最佳終止條件的確定
Tab.3Optimization condition of termination reaction

終止條件陽性IgYOD450nm陰性IgYOD450nm空白對照OD450nmP/N2mol/LH2SO40．9380．2040．0565．961mol/LH2SO41．0050．2480．0985．140．5mol/LH2SO41．0150．2690．0645．17

2.3特異性試驗如表4所示，對已知的球蟲卵囊，圓線蟲和蛔蟲蟲卵作為抗原作1∶100稀釋，同時設隱孢子蟲陽性對照和陰性對照，每份樣品重復4孔，然后應用本試驗建立的夾心ELISA檢測方法進行測定。除陽性對照外，結果均為陰性，說明該夾心ELISA方法具有良好的特異性。

表4特異性試驗
Tab.4Results of specificity test

抗原Antigen陽性對照Positivecontrol圓線蟲Nematode蛔蟲Ascarid球蟲Coccidium陰性對照NegativecontrolOD450nm1．0490．1640．1320．1520．123

2.4敏感性試驗以圖6所示，將隱孢子蟲抗原做7個2倍連續稀釋，按照已建立的夾心ELISA操作方法測定OD450nm值，結果顯示最低檢出量為1.5×104個/mL。

圖6　敏感性試驗Fig.6　Result of sensitivity Test

2.5重復性試驗以圖7，表5所示，以批內和批間重復性試驗來檢驗夾心ELISA方法的重復性，選取3份卵黃抗體樣本在不同時間、相同條件下重復做夾心ELISA測定，每個樣品重復3次，按照已建立的ELISA操作程序測定，計算同一份樣本OD450nm值的變異系數，比較試驗結果。結果顯示，隨機的3個樣品批內變異系數和批間變異系數在3.88%和8.82%之間，均小于10%，說明此檢測方法重復性好。

2.6與隱孢子蟲檢測試劑盒的比較結果本試驗建立的夾心ELISA方法的整個試驗過程比試劑盒多用15 min，敏感性低于愛德士試劑盒的最低檢出量(6×103個/mL)，特異性和重復性和其保持一致。

圖7　重復性試驗Fig.7　Results of reproducibility test

表5批內、批間重復性試驗
Tab.5Results of reproducibility test in the same and different batch

樣品ABC批內變異系數3．88%8．12%4．82%批間變異系數5．33%8．82%3．49%

2.7初步應用結果如表6所示，提取好的DNA樣品基于18S rRNA進行PCR擴增，共有8份樣品呈陽性。用建立好的夾心ELISA檢測1、2、3三組樣品分別檢測出6、7、4 份顯示隱孢子蟲陽性。3種對糞便樣品的處理方法與巢式PCR擴增方法的總符合率分別為95.83%、91.67%和83.33%。結果表明，該方法可以用于臨床樣品檢測，且糞樣在用ELISA方法檢測前的處理采用飽和蔗糖溶液漂浮法效果較好。

表63種前處理方法夾心ELISA檢測結果與PCR檢測結果效果比較
Tab.6Comparison of DAS-ELISA and RT-PCR in samples detection

　　組別陽性樣品數陰性樣品數總符合率第一組(飽和食鹽水溶液漂浮)62191．67%第二組(飽和蔗糖溶液漂浮法)72095．83%第三組(PBST洗滌液處理)42383．33%

3　討　論

隱孢子蟲具有廣泛的宿主且多具有宿主特異性[12-13]。由于隱孢子蟲群體遺傳存在較大的種內變異，其不同亞型家族的傳播方式不同，有的可以通過人和反芻動物傳播，有的只是人-人傳播[14-15]。隱孢子蟲病作為一種重要的人獸共患性原蟲病，目前尚無有效的治療方法，并且其檢出率逐年增高[16-17]。因此建立簡便、特異、敏感的免疫學診斷技術，對于人和動物隱孢子蟲病的防控具有重要意義。比較理想的微小隱孢子蟲的免疫學檢測方法，有較高的敏感性和特異性，對其他寄生蟲無交叉反應，健康動物樣品無假陽性；方法簡便易行，可在基層推廣應用[18]。夾心ELISA 是測定病原抗原的一種常用方法，該檢測方法靈敏度高、特異性強，適合大量樣品檢測，在多個領域都得到了廣泛應用[19-20]。在本研究中，以純化的兔抗隱孢子蟲IgG和雞抗隱孢子蟲IgY為基礎建立了檢測隱孢子蟲的夾心ELISA方法。經檢測和其它蟲種(球蟲卵囊，圓線蟲和蛔蟲蟲卵)無交叉反應，敏感性試驗顯示最低檢測限為1.5×104個/mL，比楊紅玉[21]建立的雙抗體夾心ELISA檢測安氏隱孢子蟲的方法更為敏感。利用所建立的夾心ELISA 與巢式PCR同時檢測臨床樣品，二者的陽性符合率為95.83%。目前國外已有商品化試劑盒面世，用于檢測糞便樣品中的隱孢子蟲卵囊[22]，國內也有此方面的報道，但未見有國產試劑盒面世。本次建立的方法與愛德仕試劑盒比較，特異性和重復性均一致，敏感性稍遜于愛德士試劑盒(分別為1.5×104個/mL和6×103個/mL)，但成本低廉。相信經過試劑的進一步優化和改進，提高檢出的靈敏度，組裝成試劑盒在臨床推廣應用為期不遠。

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