RT-LAMP與LAMP法檢測結(jié)核分枝桿菌的效果比較

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結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的嚴(yán)重影響人類健康的慢性傳染病，是至今仍然困擾人類的古老疾病之一，在古埃及木乃伊就曾發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的存在。據(jù)全球結(jié)核報(bào)告：2016年新發(fā)結(jié)核病1 040萬[1]，隨著耐藥與多重耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病的控制難度不斷增加[2-4]，而建立快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的診斷方法對結(jié)核病的防治工作具有重要意義[5]，也是進(jìn)行早期隔離、診治的前提[6-7]。目前結(jié)核病的診斷方法主要是痰涂片抗酸染色法、羅氏固體培養(yǎng)法(L-J medium culture，L-J)、液體快速培養(yǎng)法、核酸擴(kuò)增等方法，染色涂片雖然簡單易行，但敏感性差，檢出率低[8]，并且不能鑒別死菌活菌，亦不能分辨MTB與非結(jié)核分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria,NTM)；羅氏固體培養(yǎng)法培養(yǎng)周期長，需要4～8周[9]，改進(jìn)后液體快速培養(yǎng)系統(tǒng)將時(shí)間縮短到10 d左右[9-10]，但花費(fèi)昂貴且容易受到污染，只能檢出活力旺盛的菌[11]，并且培養(yǎng)法不能鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌[12-13]；以擴(kuò)增核酸為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，具有快速、靈敏、特異強(qiáng)等特點(diǎn)，比如PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)等[14]，但因PCR技術(shù)對操作人員技能有較高要求，需要的熱循環(huán)設(shè)備價(jià)格昂貴而很難得到推廣。LAMP克服了上述缺點(diǎn)，具有反應(yīng)快速、操作簡單的優(yōu)勢，一臺水浴鍋等恒溫設(shè)備在50 min左右即可完成操作，擴(kuò)增結(jié)果可用肉眼判定，簡單培訓(xùn)即可完成操作，適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用[15-16]。2016年8月WHO推薦發(fā)展中國家的基礎(chǔ)醫(yī)療單位使用新的檢測方法TB-LAMP,這種方法可以替代痰涂片方法[17]。但PCR、LAMP等分子生物學(xué)檢測法是針對結(jié)核桿菌DNA基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)的引物并進(jìn)行擴(kuò)增的，對死菌或活菌都呈現(xiàn)陽性結(jié)果，無法在臨床上評估抗結(jié)核治療效果，也無法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，且DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定，不易降解，易污染。結(jié)核桿菌16S rRNA為單鏈結(jié)構(gòu)，脆弱易降解，半衰期短，不易污染，僅存在于代謝增殖的活菌中，占總RNA的80%，與16S rDNA的單一拷貝相比較，而16S rRNA在一個(gè)結(jié)核分枝桿菌里可達(dá)數(shù)萬個(gè)，故選擇合并反轉(zhuǎn)錄功能的逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(reverse transcription-LAMP，RT-LAMP)不僅有助于判定活菌，而且可以進(jìn)一步提高靈敏性[18-20]。RT-LAMP和LAMP技術(shù)相似，只是擴(kuò)增體系中模板為RNA且多加入了逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。本研究以結(jié)核分枝桿菌16S rRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物，用同一引物對結(jié)核桿菌的16S rRNA使用RNA-LAMP法檢測與傳統(tǒng)的DNA-LAMP法進(jìn)行檢測，以L-J法做對比，比較其靈敏度與特異性。

1　材料與方法

1.1樣本來源收集中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院感染科2015年11月-2016年12月確診肺結(jié)核的就診者痰液100例，其中男性62例，女性38例，年齡在15～80歲，從我院呼吸科收集排除結(jié)核菌感染的其他細(xì)菌感染的對照組痰液樣本22例，其中有3份經(jīng)痰培養(yǎng)確定為金黃色葡萄菌肺炎、銅綠假單胞菌肺炎、肺炎克雷伯肺炎患者痰標(biāo)本，所有患者簽署知情同意書。

1.2菌株與試劑結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，非結(jié)核分枝桿菌：胞內(nèi)分枝桿菌、海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥結(jié)核分歧桿菌、淺黃分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。改良羅氏培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自己配制，細(xì)菌DNA提取試劑盒購自上海生工，RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自QIAGEN。

1.2.1痰標(biāo)本處理取痰標(biāo)本，加入痰液2倍體積的RNA保護(hù)劑，用2倍體積2% N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-NaOH溶液進(jìn)行消化[21]，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋震蕩2 min，直至痰標(biāo)本充分液化，取0.1 mL痰標(biāo)本接種于改良酸性羅氏培養(yǎng)基中，余痰用于提取RNA與DNA儲存于-80 ℃冰箱，同一患者的標(biāo)本取相同體積的痰液，分別按照DNA與RNA提取試劑盒提取，RNA提取時(shí)根據(jù)試劑盒提示加入DNase I進(jìn)行處理。

1.2.2RT-LAMP引物設(shè)計(jì)從NCBI數(shù)據(jù)庫下載非結(jié)核桿菌16S rRNA全序列，用Clustal Omega工具將結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(GenBank號： NR_102810.1)與各種非結(jié)核桿菌進(jìn)行序列對比，非結(jié)核桿菌包括：胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulareNR_074661.1)、海分支桿菌(M.marinumNR_025214.1)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasiiNR_121712.1)、鳥結(jié)核分枝桿菌(M.aviumNR_102855.1)、淺黃分枝桿菌(M.flavescensNR_044815.1)、恥垢分枝桿菌(M.segmatisNR_074718.1)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitumX65529.1)、龜分枝桿菌(M.chelonaeAF480594.1)。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)高變區(qū)170-210 bp處和430-490 bp處，從而確定特異引物的設(shè)計(jì)區(qū)段。然后用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V5，針對該區(qū)段設(shè)計(jì)多套特異引物，比較每套引物的3′端位點(diǎn)的特異性并使用BLAST工具進(jìn)一步驗(yàn)證其特異性，最后選出最佳引物。本實(shí)驗(yàn)選用1-210 bp區(qū)段設(shè)計(jì)特異引物如圖1，引物序列如表1，所有引物由上海生工公司合成。表1中F3和B3為RT-LAMP外引物，F(xiàn)IP和BIP為RT-LAMP內(nèi)引物,其中內(nèi)引物由兩段相鄰的正反序列組成。FIP由F1c(F1的互補(bǔ)區(qū)段)和F2組成，BIP由B1c(B1的互補(bǔ)區(qū)段)和B2組成。

圖1　RT-LAMP引物的相對位置和特異識別位點(diǎn)Fig.1　Relative positions and specific recognition sites of RT-LAMP

表1以16S rRNA為靶序列的RT-LAMP引物
Tab.1RT-LAMP primers for targeting 16S rRNA

NameSequence(5′?3′)Length/bpF3TCCTGGCTCAGGACGAAC18B3CGCTTTCCACCACAAGACAT20FIP(F1c+F2)TCGCCACTCGAGTATCTCCGAA?GCGGCGTGCTTAACACAT40BIP(B1c+B2)AGTAACACGTGGGTGATCTGCC?ATCCCGTGGTCCTATCCG40

1.2.3RT-LAMP反應(yīng)體系25 μL體系包括：1.6 μmol/L內(nèi)引物(FIP和BIP)，0.2 μmol/L外引物(F3和B3)，0.8 mol/L 甜菜堿(Sigma，USA)，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA聚合酶(New England BioLabs,Ipswich,MA,USA)、20 U重組核糖核酸酶抑制劑(Invitrogen)、100 U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 (Vazyme)、2.5 μL 10×buffer，1 μL模板RNA或DNA，最后加入1 μL鈣黃綠素和MnCl2混合液(濃度分別0.05 mmol/L和0.6 mmol/L)，用去離子水補(bǔ)足25 μL。同時(shí)用未加入模板的體系作為陰性對照。將反應(yīng)管置于60 ℃恒溫水浴箱內(nèi)反應(yīng)50 min，然后常溫下或冰盒中終止反應(yīng)。擴(kuò)增完成后，體系變綠色是為陽性，保持淡橙色是為陰性，同時(shí)對比了RT-LAMP和LAMP反應(yīng)體系的溫度與時(shí)間，并進(jìn)行了優(yōu)化，將擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在凝膠中電泳約25 min以驗(yàn)證結(jié)果。

1.2.4RT-LAMP的靈敏度將結(jié)核分枝桿菌菌液10倍梯度稀釋，取各稀釋度菌液2 mL分別提取RNA與DNA，然后進(jìn)行RT-LAMP與LAMP檢測，測試兩種方法靈敏度，重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn)，以凝膠電泳和鈣黃綠素染色進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.5RT-LAMP的特異性以結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為陽性對照，其他肺部細(xì)菌感染者及常見的非結(jié)核桿菌及作為陰性對照，用RT-LAMP方法，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果并進(jìn)行特異性比較。

1.2.6RT-LAMP的檢測極限使用核酸蛋白分析儀(Eppendorf，Germany)對純化的結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)株RNA進(jìn)行多次測量，取平均值作為真實(shí)RNA含量值，并用去離子水調(diào)至1 ng/μL作為RT-LAMP實(shí)驗(yàn)的模板。用去離子水對模板進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)公式：

其中340為一個(gè)RNA分子量，目的基因?yàn)殚L度為16S rRNA 全長1 537 kb，16S rRNA 占總RNA的80%，經(jīng)計(jì)算得1 g約等于1018，即1 ng約相當(dāng)于109copy RNA，1 ag約相當(dāng)于1 copy RNA。用RT-LAMP法進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)結(jié)果評價(jià)RT-LAMP的檢測極限。

1.2.7RT-LAMP和LAMP產(chǎn)物酶切鑒定反應(yīng)結(jié)束后,采用限制性內(nèi)切酶XhoI進(jìn)行酶切鑒定,30 μL酶切體系如下:RT-LAMP 產(chǎn)物或LAMP產(chǎn)物3 μL、Q.CUT.10×buffer 3 μL、XhoI 1 μL去離子水補(bǔ)足23 μL,37 °C 作用1 h。酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.8統(tǒng)計(jì)分析用本研究的RT-LAMP法和LAMP法對采集的臨床樣本進(jìn)行擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 21.0。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用靈敏度、特異度。檢測結(jié)果比較用卡方檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)　果

2.1RT-LAMP與LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化RT-LAMP由于新加入反轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)時(shí)間約50 min，對比不同反應(yīng)溫度(56 ℃、 58 ℃、 60 ℃、 63 ℃、 65 ℃)對酶的影響，如圖2(A)所示，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，RT-LAMP特異性條帶非常清晰，溫度過高可使反轉(zhuǎn)錄酶活性降低，反應(yīng)結(jié)果不理想，LAMP反應(yīng)Bst DNA聚合酶的最適溫度一般63 ℃～65 ℃[22-23]，如圖2(B)60 ℃～65 ℃均有反應(yīng)，當(dāng)溫度為60 ℃，Bst DNA 聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶都具有較高的活性，故本RT-LAMP實(shí)驗(yàn)選取60 ℃為最適溫度。同樣的，在我們對比不同反應(yīng)時(shí)間(5 min、15 min、30 min 、40 min、50 min)對RT-LAMP及LAMP反應(yīng)的影響，RT-LAMP與LAMP選取反應(yīng)溫度60 ℃與65 ℃，從圖3(A)中可以看出RT-LAMP反應(yīng)15 min就可以觀察到擴(kuò)增條帶，反應(yīng)30 min和50 min時(shí)都可以得到很清晰明亮的特異性條帶，圖3(B) LAMP反應(yīng)30 min才可以看到擴(kuò)增條帶，50 min可看到明亮的條帶，本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間確定為50 min使擴(kuò)增反應(yīng)更加徹底。

M：250 bp DNA maker；1-4：56 ℃、 58 ℃、 60 ℃、63 ℃、63 ℃；6.陰性對照。M: 250 bp DNA marker.Lanes 1-5: 56 ℃,58 ℃,60 ℃,63 ℃ and 65 ℃.Lane 6: negative control.圖2　不同溫度的RT-LAMP(A)與LAMP (B)電泳圖Fig.2　The electrophoresis for different temperature amplifications of (A) RT-LAMP and (B) LAMP

M:250 bp DNA maker；1-5：5 min、15 min 、30 min、40 min、50min；6.陰性對照。M:250 bp DNA marker.Lanes 1-5: 5,15,30,40and 50 min.Lane 6: Negative control.圖3　不同時(shí)間的RT-LAMP(A)與LAMP(B)電泳圖Fig.3　Amplification starting times of (A) RT-LAMP and (B) LAMP

2.2RT-LAMP與LAMP的敏感度經(jīng)載玻片直接顯微鏡計(jì)數(shù)法，選取原始結(jié)核分枝桿菌菌液濃度1.0×107菌/mL，再進(jìn)行10倍梯度稀釋后分別提取RNA與DNA，進(jìn)行RT-LAMP與LAMP檢測，顯示RT-LAMP檢測該菌的靈敏度為1.0×100菌/mL(圖4A)，而LAMP方法檢測該菌的靈敏度為1.0×101菌/mL(圖4B)，反應(yīng)RT-LAMP比LAMP法的靈敏性高約10倍。

(A)RT-LAMP凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖；(B)LAMP凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖。M：250 bp DNA maker；1-9：1.0×107、 1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100、1.0×10-1 菌/mL；10.陰性對照。(A)Electrophoresis and Calcein staining pattern of RT-LAMP(B)Electrophoresis and Calcein staining pattern of LAMP；M：250 bp DNA maker；1-9：1.0×107,1.0×106,1.0×105,1.0×104,1.0×103,1.0×102,1.0×101,1.0×100,1.0×10-1 bacterium/ml,10.negative control。圖4　RT-LAMP和LAMP的靈敏度實(shí)驗(yàn)Fig.4　Sensitivity assay of RT-LAMP and LAMP

2.3RT-LAMP特異性如圖5所示，RT-LAMP能特異性地?cái)U(kuò)增出結(jié)核分枝桿菌，而其他其細(xì)菌及非結(jié)核分支桿菌均未擴(kuò)增出特異性條帶,說明RT-LAMP引物特異性強(qiáng)。

AB:RT-LAMP凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖M：250 bp DNA maker；A:1-4：肺結(jié)核、金黃色葡萄菌肺炎、銅綠假單胞菌肺炎、肺炎克雷伯肺炎患者痰標(biāo)本； B: 1-9：結(jié)核桿菌H37Rv、胞內(nèi)分枝桿菌、海分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、鳥結(jié)核分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌。AB:Electrophoresis and Calcein staining pattern of RT-LAMP； M：250 bp DNA maker；A:1-4：sputum samples of tuberculosis、Staphylococcus aureus pneumonia,Pseudomonas aeruginosa pneumonia,Klebsiella pneumoniae pneumonia B: 1-9：M.tuberculosis H37Rv,M.intracellulare,M.marinum,M.kansasii,M.avium,M.flavescens,M.segmatis,M.fortuitum,M.chelonae.圖5　RT-LAMP的特異性實(shí)驗(yàn)Fig.5　Specificity assay of RT-LAMP

2.4RT-LAMP的檢測極限通過對倍比稀釋1 ng/μL H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行RT-LAMP，重復(fù)3次后，結(jié)果RT-LAMP檢測極限均可達(dá)到1 ag約1 copy，說明了RT-LAMP靈敏度極高，只要有結(jié)核菌的存在就可以被檢出(圖6)。

RT-LAMP凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖；M：250 bp DNA maker；1-10: 0.1 ng、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100 ag、10 ag、1 ag、0.1 ag /μL；11：陰性對照Electrophoresis and Calcein staining pattern of RT-LAMP.M:250 bp DNA maker,1-10: 0.1 ng,10 pg,1 pg,100 fg,10 fg,1 fg,100 ag,10 ag,1 ag,0.1 ag /μL,11: negative control.圖6　RT-LAMP檢測極限實(shí)驗(yàn)Fig.6　RT-LAMP detection limit assay

2.5RT-LAMP 與LAMP產(chǎn)物酶切鑒定為驗(yàn)證RT-LAMP 與LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物為結(jié)核分枝桿菌特異性產(chǎn)物，用同一引物擴(kuò)增 RT-LAMP 與LAMP目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物均為192 kb片段，經(jīng)XhoI酶切成大小約80 kb片段，如圖7 所示出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶。RT-LAMP出現(xiàn)2條條帶可能與RT-LAMP 產(chǎn)物量巨大，在相同反應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，部分片段未能完全酶切有關(guān)。

(A)RT-LAMP酶切實(shí)驗(yàn)，M: 250 bp DNA marker(B)LAMP酶切實(shí)驗(yàn)，M: 100 bp DNA marker；1-2酶切前后 (A) RT-LAMP.M: 250 bp DNA marker.(B) LAMP.M: 100 bp DNA marker.Lane 1,before the digestion.Lane 2,RFLP pattern.圖7　酶切產(chǎn)物分析Fig.7　Restriction enzyme digestion analysis

2.6臨床樣本檢測RT-LAMP與LAMP對同一痰標(biāo)本檢測結(jié)果如圖8所示，RT-LAMP的擴(kuò)增結(jié)果中對培養(yǎng)法與LAMP法檢測不到的結(jié)核菌仍能檢測陽性。說明RT-LAMP較LAMP敏感性強(qiáng)，比較敏感性(如圖8)，以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，用RT-LAMP與LAMP對122例痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，3種方法陽性率RT-LAMP法100%、LAMP法92%、L-J法88%，RT-LAMP與L-J差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)，LAMP和L-J但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。 RT-LAMP與LAMP差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義意義(P<0.05，表2)，RT-LAMP陽性率高于LAMP。

(A) RT-LAMP凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖；(B)LAMP凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖。M：250 bp DNA marker；1-4：肺結(jié)核患者痰標(biāo)本；5.陰性對照。(A)Electrophoresis and Calcein staining pattern of RT-LAMP(B)Electrophoresis and Calcein staining pattern of LAMP；M：250 bp DNA maker；1-4 ：Sputum samples from patients with tuberculosis；5.negative control 圖8　RT-LAMP和LAMP的臨床樣本的檢測Fig.8　Test results of clinical samples assay of RT-LAMP and LAMP

表2臨床樣本的檢測結(jié)果
Tab.2Test results of clinical samples

DetectionMTBaNon?MtbPL?J+880—-1222—RT?LAMP+1000<0．01b-022—LAMP+920>0．05c-822<0．05d

aMTB患者，n=100; Non-Mtb患者，n=22;bRT-LAMP與L-J相比的靈敏度;cLAMP與L-J相比的靈敏度;dRT-LAMP與LAMP相比的靈敏度

aMTB patients,n=100; Non-Mtb patients,n=22；bThe sensitivity of RT-LAMP compared to L-J；cThe sensitivity of LAMP compared to L-J；dThe sensitivity of RT-LAMP compared to LAMP.

3　討　論

目前，結(jié)核病發(fā)病人數(shù)仍然居高不下，WHO制定結(jié)核防治目標(biāo)是到2025年，要使全球結(jié)核病的發(fā)病率呈每年10%的速率下降，到2035年，全球要終止結(jié)核病的流行，要達(dá)到這一目標(biāo)，優(yōu)化現(xiàn)有的結(jié)核病診斷技術(shù)至關(guān)重要[1]，而目前作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的培養(yǎng)法盡管能鑒別結(jié)核分枝桿菌活菌與死菌，但是培養(yǎng)周期長，且不能分辨MTB與NTM，近年來，NTM的感染率逐漸上升，它與結(jié)核桿菌感染的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征及其相似，形態(tài)學(xué)上難以鑒別，但治療差異大[24-25]，許多結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物天然耐藥，常規(guī)化療效果不佳，尤其對于HIV合并肺部感染NTM患者，常被誤認(rèn)為結(jié)核[25-27]，從而延誤治療，此實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP技術(shù)特異性強(qiáng)，能夠鑒別結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌，利于指導(dǎo)用藥。傳統(tǒng)的結(jié)核核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)都是針對結(jié)核菌DNA進(jìn)行的[28-30]，無法檢測出有活力的菌，并不能評估臨床化療效果。16S rRNA半衰期短，僅存在于有代謝活性的活菌中，本實(shí)驗(yàn)用RNA保護(hù)試劑對活體菌預(yù)前處理，用RT-LAMP技術(shù)檢測結(jié)核菌RNA，避免了結(jié)核菌殘留DNA引起的假陽性結(jié)果，在指導(dǎo)臨床治療上有一定意義。

LAMP技術(shù)自問世以來以其操作簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)顯示了諸多優(yōu)勢。通過對臨床樣本檢測，結(jié)果表明RT-LAMP法陽性檢測率高于LAMP法與培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)陰性并不代表痰標(biāo)本中沒有結(jié)核分枝桿菌，有可能是由于細(xì)菌的數(shù)量低于檢測限造成的。由于16S rRNA拷貝是DNA的103-105倍[19]，故RT-LAMP靈敏度極高，反應(yīng)迅速，可重復(fù)檢測單一拷貝，15 min即可看到擴(kuò)增結(jié)果，與預(yù)期的RT-LAMP靈敏度是LAMP 103-105相比，靈敏度實(shí)驗(yàn)證明RT-LAMP比LAMP靈敏度高約10倍，可能由于以下原因引起的：1)RNA易降解衰減，提供有效的模板減少；2)RNA半衰期短，逆轉(zhuǎn)錄效率低；3)RNA單鏈啟動效率低于雙鏈啟動效率；4)LAMP反應(yīng)啟動后的高效率及高靈敏性等[31]，盡管如此，RT-LAMP仍在靈敏度及活菌檢測方面有不可超越的優(yōu)勢。盡管Lee等已經(jīng)報(bào)道過RT-LAMP檢測結(jié)核桿菌，但Lee等使用酶聯(lián)免疫法(ELISA)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，這種方法相對昂貴(10美元)且耗時(shí)(5 h)，不利于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的使用[32]。總之，本研究中的RT-LAMP技術(shù)操作簡單、檢測快速、特異性高、靈敏度強(qiáng)、可檢測活菌，顯示了適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的多處優(yōu)勢，近年來有學(xué)者研究從樣本處理到結(jié)果判讀一體化的便攜式微型生化反應(yīng)系統(tǒng)，如微流控芯片、毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)室。如果能有更便捷、經(jīng)濟(jì)的定量檢測，將更加有利于結(jié)核桿菌的臨床診斷及治療，2035年終止結(jié)核病的目標(biāo)將會更近一步。

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