規模化豬場O型口蹄疫抗體水平監測與分析

張俊波，印雙紅 ，陸安法 ，白 明，陸志松

（1.銅仁學院農林工程與規劃學院（銅仁市文化科技產業創新研究中心），貴州 銅仁 554300； 2.銅仁學院大健康學院，貴州 銅仁 554300；3.銅仁市動物疫病預防控制中心，貴州 銅仁 554300）

0　引言

口蹄疫( Foot-and-mouth disease， FMD) 是 由 口 蹄 疫 病 毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)所引起的偶蹄動物的一種急性高度接觸性傳染病[1]。該病一旦發生可呈暴發性流行，其中包括牛、水牛、豬、綿羊、山羊和駱駝等20個科的70多種家養和野生哺乳動物容易受其感染[2]。據調查顯示與一般傳染病不同的是它較易從一種動物傳給另一種動物，且由于病毒型不同 ，因此，每個單獨的病毒型都可引起動物的一次發病，新流行地區發病率可達100%，老疫區發病率在50 %以上[3]。在世界動物衛生組織(OIE)與聯合國糧農組織 (FAO)的排行榜上口蹄疫就穩居“A類動物傳染病之首”的位置[4]。早在14世紀的時候意大利學者第一次描述了FMD，1898年，Loeffler等人證明了口蹄疫的病原體為濾過性的病毒，已經發現口蹄疫的病原體主要有7個血清主型（O型、A型、C型、亞洲Ⅰ型、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南非Ⅲ型），2013年在我國發生的口蹄疫疫情主要是O型和A型[5，6]。

目前，FMD在世界的分布很廣，是國際間相互進行傳播流行蔓延的世界性傳染病，幾乎所有的國家都有記載，在1514年首次在意大利報道以來，最近的一個世紀就先后在美國、墨西哥、加拿大、丹麥、中國等國家和地區出現，給全球畜牧業和世界貿易帶來嚴重的危害，每年用于預防和損失賠償的耗資就達60～120億美元，2012年世界動物衛生組織的統計數據顯示：全世界已經消滅口蹄疫的國家69個，新西蘭則是歷史上從未發生口蹄疫的國家[7]。我國流行的血清型（O型、A型）給口蹄疫防治提出巨大的要求，且由于造成嚴重的經濟損失和社會影響，歷來受到各國政府的關注，針對口蹄疫的治療尚無有效藥物，疫苗免疫是最有效的一個方法[8]。業界內最為關心的話題是豬群口蹄疫的免疫效果，口蹄疫的免疫效果能直接影響豬群的健康狀況，體現出抗體水平和保護率高低的差異，而影響免疫效果的原因有很多，如疫苗種毒的抗原性、疫苗的質量、豬群的健康狀況等，我國豬群現使用的口蹄疫滅活(合成) 疫苗普遍存在免疫原性欠佳的情況，養豬場采取多次強化免疫的方法來提高抗體水平，但如何使各生理階段的豬只都達到足夠高的抗體水平，在什么情況下要進行多次強化免疫等方面未達成共識[9]。經調查貴州地區對豬O型口蹄疫抗體水平監測的統計較少，貴州累計有三次監測統計：2007年文明等人采用LB-ELISA方法對貴陽地區家畜口蹄疫免疫抗體監測結果分析[10]。2009年秋季動物防疫期間，劉波等人采用口蹄疫正向間接血凝試驗對黎平縣豬口蹄疫免疫抗體進行監測及分析[10]；2013年6月，趙福崴等人在春季動物疫病集中免疫期間采用酶聯免疫吸附試驗對遵義市豬O型口蹄疫進行監測[11]。

養殖業是銅仁地區一大特色產業，且養豬作為當地居民一個經濟來源，大多數人以豬肉為主要肉食，由于地方經濟比較落后，豬場規模不大，一般屬于小規模豬場(＞100頭)，豬口蹄疫又是嚴重危害養豬業的傳染病，且銅仁市各個縣城和市區的豬肉市場主要是由這些豬場提供貨源，所以這些豬場的豬是否健康直接影響各個縣城和市區人民的健康。養豬業遵循“預防為主，防重于治”的有效方針，所以全面了解銅仁市豬口蹄疫免疫水平至關重要。本次調查于2015年5月、11月對銅仁市8個縣、2區的各鄉（鎮）隨機抽取17個規模養豬場內保育豬、肥育豬、公豬、母豬、哺乳仔豬進行春、秋兩次豬O型口蹄疫血清學調查工作，收集數據，比較不同地區春季和秋季的免疫抗體水平情況，為銅仁地區的口蹄疫的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1 血清樣品準備

隨機抽取的銅仁市8縣2區共17個規模化豬場定點場，每個豬場隨機采取30份經口蹄疫疫苗免疫接種21 d以上的育肥豬108份、保育豬117份、哺乳仔豬121份、母豬60份、公豬104份豬血清樣本，春、秋各采取510份，見表1。

1.2 材料和儀器

1.2.1 試劑與器材

豬O型口蹄疫病毒ELISA抗體檢測試劑盒（由武漢某公司提供，批號，20150412，20150410，20151002）。

1.2.2 主要儀器

振動器；自動酶標儀（美國BioTek儀器有限公司）；單道微量移液槍（eppendorf公司）；8道微量移液槍（Thrmo公司）；恒溫培養箱（北京市光明醫療儀器廠）。

1.3 樣品采集時間、方法及儲存

1.3.1 采集時間

血清共分為兩次均等采集，分別是2015年5月和2015年11月。

1.3.2 樣品采集方法及儲存

對選定的豬要進行前腔靜脈采血，具體方法分為3個步驟，如下：

1）豬的保定

對中大豬的保定：用保定繩套住豬的上腭，將繩子斜向上，至豬的頸部皮膚充分崩緊，左右顯出兩個較深的窩。對仔豬的保定：直接仰臥。

2）進針采血

將豬保定后，選取左右兩個窩中較深的一個作為進針點，選定進針點，用碘酊消毒，手持一次性采血盛血器，從對側肩胛骨呈 45°方向刺入，抽取5 mL血液。

3）血清制備

抽取血液完后立即置于30℃左右環境，傾斜靜置半小時左右，每份吸取血清1 mL于 1.5 mL EP 管，要求血清清亮無溶血，做好標記，-20 ℃保存。

1.4 試驗方法與結果判定

1.4.1 間接ELISA原理

在試驗中加入稀釋的對照血清和待測血清，經溫育后，若樣品中含有豬口蹄疫病毒VP1的特異性抗體，則與包被板上的抗原結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分，再加酶標二抗，與包被板上抗原抗體復合物發生特異性結合，再經洗滌除去未結合的酶結合物，在每孔中加入TMB底物液，與酶反應形成藍色產物，再加入HF溶液終止反應后，用酶標儀630 nm波長測定各反應孔中的測OD630值，

1.4.2 試驗操作步驟

1）解凍。取出冷凍的待測血清置于室溫（20～25 ℃），充分解凍后，震蕩混勻以備用。

2）將冷藏保存的試劑盒放置室溫，使其恢復至室溫（20～25 ℃）備用。

3）使用前，將恢復至室溫（25 ℃）的濃縮洗滌液搖動并使沉淀溶解（最好在37 ℃水中加熱5～10 min），然后根據實驗用量用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋盛于燒杯中備用。做好這些準備工作即可進行檢測，流程如下：

4）取抗原包被板（根據樣品的多少，可拆分使用），每孔加入稀釋好的洗滌液200 μL，靜置3 min倒掉液體，并在吸水紙上拍干，共計洗板2次。在分別將稀釋好的待測血清和對照各取100 μL加入到抗原包被板孔中，待檢樣品做1孔，陰性對照和陽性對照各設2孔，輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37 ℃溫育30min。

5）甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200 μL、靜置3 min倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌5次。

6）每孔加入羊豬酶標二抗100 μL，置37℃溫育30min。

7）洗滌5次，方法同5），每次在干凈吸水紙上拍干。

8）按步驟6）的操作方法再次進行洗滌。

9）洗滌完后，充分拍干包被孔中的液體，先后加入底物A50 μL，再加底物50 μL，混勻，室溫（20～25 ℃）避光顯色10 min。

10）顯色后每孔加入終止液50 μL，10 min內 用 酶 標 儀 測 定630 nm波長的吸光度值（測定前在振蕩器上輕輕振動一下）。

表1　采集信息統計表

1.4.3 結果判定

在酶標儀上測各孔的OD630nm值。試驗成立的條件是陽性對照平均OD630nm值均≥0.8，陰性對照平均OD630nm值＜0.3。樣品OD630nm值≥0.4時判為陽性。樣品OD630nm值＜0.4，判為陰性。嚴格按照試劑盒使用說明書上的步驟測定其樣品OD值。根據農業部規定免疫合格率≥70.00%為免疫合格。

1.4.4 數據處理與統計分析

用Excel軟件進行原始的數據處理與統計分析。

2　結果及分析

2.1 不同季節豬O型口蹄疫抗體監測結果與分析

2.1.1 不同季節豬O型口蹄疫抗體免疫水平監測結果分析

檢測結果見表2和表3，春季陽性414份，平均合格率為81.83%，從分地區來看免疫合格率較高的有思南縣91.67%、石阡縣91.67%，江口縣93.33%，免疫合格率較低的為松桃縣68.33%、德江縣65.00%。分地區免疫合格率總趨勢為江口縣＞（思南縣、石阡縣）＞碧江區＞沿河縣＞（印江縣、萬山區）＞玉屏縣＞松桃縣＞德江縣。此結果說明春季監測的豬O型口蹄疫抗體，平均合格率為82.67%大于農業部規定的標準（≥70.00%），只有碧江區、萬山區、思南縣、印江縣、石阡縣、沿河縣、江口縣、玉屏縣8個地區免疫合格率達到農業部標準，而松桃縣（68.33%）、德江縣（67.50%）免疫合格率未達到農業部的標準。秋季陽性435份，平均免疫合格率為85.00%，從分地區去來看石阡縣免疫合格率，最高96.67%，最低合格率松桃縣70.00%，免疫合格率總趨勢為沿河縣＞石阡縣＞思南縣＞碧江區＞江口縣＞印江縣＞玉屏縣＞萬山區＞德江縣＞松桃縣。此結果說明秋季監測的豬O型口蹄疫抗體，平均合格率87.58%達到農業部規定的標準（≥70.00%），且各地區的免疫合格率均≥70.00%，抽取的各地區豬O型口蹄疫免疫效果較好。

2.1.2 不同季節豬O型口蹄疫免疫檢測結果比較分析

經比較，春秋兩季各檢測的510份豬血樣中，首先春季陽性414份，秋季陽性435份，平均合格率春季（81.83%）＜秋季（85.00%），免疫合格率呈上升的趨勢（秋季相對于春季上升了3.17%），免疫合格率只有碧江區、萬山區、思南縣、印江縣、石阡縣、沿河縣、江口縣、玉屏縣8個地區免疫合格率達到農業部標準，而松桃縣（68.33%）、德江縣（65.00%）免疫合格率未達到農業部的標準，即春季監測豬O型口蹄疫抗體有兩個地區出現了免疫未達到國家農業部規定的標準，而秋季監測的各個地區都達到農業部規定的標準，此情況說明在春季的基礎上部分地區的豬O型口蹄疫免疫情況有所改善，如在春季監測的松桃縣、德江縣兩個地區的免疫合格率分別為68.33%、65.00%并未達到農業部規定的標準，而在秋季監測結果中松桃縣、德江縣免疫合格率分別達到70.00%、75.00%。此結果說明2015年兩次監測豬O型口蹄疫抗體中，各地區秋季豬O型口蹄疫免疫抗體水平要高于春季豬O型口蹄疫免疫抗體的水平。

表2　春季豬O型口蹄疫檢測結果

表3　春季豬O型口蹄疫檢測結果

2.2 不同類型豬O型口蹄疫抗體水平結果分析

對兩次檢測的血清樣品不同類型豬O型口蹄疫抗體分析，如表4。春季平均陽性率74.10%，公豬陽性率94.23%，陽性率最高，其次是母豬77.78%，依次是育肥豬72.22%、保育豬70.08%、哺乳仔豬56.20%。秋季平均陽性率81.70%，母豬陽性率95.56%，陽性率最高，其次是育肥豬89.81%，然后依次是公豬88.46%、保育豬74.35%、哺乳仔豬60.33%。從整體水平上分析，春、秋季各類型豬陽性水平較高，哺乳仔豬的陽性率較低。

3　討論

3.1 口蹄疫的傳播途徑及防御措施

口蹄疫是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄動物急性高度接觸性傳染病，其危害的動物種類非常之多，傳播速度極快，是其他動物疫病所無法比擬的，目前我國所采用預防口蹄疫的一個重要手段是通過免疫接種口蹄疫疫苗來提高畜群整體的抗體水平，而免疫抗體水平的監測是評估畜群免疫效果的一種重要方式[12]，檢測結果中秋季平均免疫合格率85.00%高于春季平均免疫合格率81.83%，可能是5月份相對于11月份溫度高，空氣濕度不同導致的，口蹄疫傳播的途徑有空氣傳播和接觸傳播兩種，即可經吸入、攝入、外傷、人工授精及近距離接觸而傳染，因此要特別注意豬群氣源、圈舍、牧場、集貿市場、運輸車輛，針對口蹄疫的防治措施每個國家根據本國實際情況采取封鎖、撲殺、焚燒措施和制定出相應的預防、控制、撲滅措施，我國口蹄疫的應對免疫預防的核心措施是對口蹄疫易感動物有針對性地接種疫苗，提高動物抗感染能力，斷絕病毒繁殖機會，撲殺病畜及同群畜，而病畜及其同群畜是最危險的傳染源[13]。

表4　不同類型豬O型口蹄疫抗體陽性率表

3.2　2015年銅仁地區豬O型口蹄疫血清學調查情況

銅仁地區2015年豬O型口蹄疫抗體水平監測時間分別是5月與11月，在17個規模養豬場，分別隨機抽取采自碧江區、萬山區、思南縣、松桃縣、德江縣、印江縣、石阡縣、沿河縣、江口縣、玉屏縣8縣2區的豬血清樣品，共計1020份，免疫合格份數849份，春季陽性414份，平均免疫合格率81.83%，秋季陽性435份，平均免疫合格率85.00%，春季、秋季平局免疫合格率均大于農業部規定的標準（≥70.00%），表明2015年銅仁地區免疫效果較好。不同階段豬O型口蹄疫免疫合格率變化情況，春季陽性率56.20%～94.23%，公豬陽性率最高；秋季陽性率60.33%～95.56%，母豬陽性率最高，兩次監測都說明哺乳仔豬免疫水平較低。

3.3 銅仁地區豬O型口蹄疫抗體水平差異較大

規模養殖場應重視豬O型口蹄疫抗體監測，開展抗體監測的目的不僅僅是診斷，更主要的是評價豬群的免疫狀況，并根據其監測結果對免疫方案進行適當的調整或提供一些預警 ，本次對銅仁地區17個規模場的監測中，春季平均免疫合格率81.33%，秋季平均免疫合格率85.00%，趨勢表現為秋季免疫合格率高于春季，且平均免疫合格率均達到農業部規定的標準，2015年5月楊先富等人對黔東南州16個縣(市) 的16個規模養豬場和16個自然村散養生豬開展了血清學調查中，對豬O型口蹄疫免疫抗體水平的檢測情況分析用平均免疫合格率（規模場豬O型口蹄疫免疫血清免疫抗體平均合格率為96.55%，散養戶免疫抗體平均合格率為73.91%）的變化趨勢來確定豬O型口蹄疫的抗體水平[14]，由表3和表4的檢測結果不同地區的免疫合格率不相同，其中春季分地區碧江區88.33%（53/60）萬山區80.00%（24/30）、思南縣91.67%（55/60）、松桃縣68.33%（41/60）、德江縣65.00%（39/60）、印江縣80.00%（32/40）、石阡縣91.67%（55/60）、沿河縣83.33%（25/30)、江口縣93.33%（28/30)、 玉 屏 縣 76.67%（46/60），秋季分地區合格率碧江區91.67%（55/60）、萬山區83.33%（25/30）、思南縣93.33%（56/60）、松桃縣70.00%（42/60）、德江縣75.00%（30/40）、印江縣86.67%（52/60）、石阡縣96.67%（58/60），各地區的免疫合格率明顯不相同，張智鵬等2012年10月，采用正向間接血凝試驗對漢中轄區內的生豬進行了口蹄疫免疫抗體監測，得出規模場與散養戶的合格率顯示不同地區的合格率不相同的情況[15]，因此要讓各個地區的免疫情況都處在相同水平上是達不到的。

3.4 部分地區豬O型口蹄疫抗體水平有待提高

檢測結果顯示，部分地區免疫合格率較低，如在春季監測的松桃縣、德江縣兩個地區的免疫合格率分別為68.33%、67.50%，并未達到農業部規定的標準，說明免疫程序的某環節未做到位，筆者認為有幾下原因：1）在免疫程序及防治上不科學或者執行力不夠，因為科學合理的免疫程序及防治能夠保證免疫成功率，也能確保其他動物免受疫病的感染，從而使畜群抵御口蹄疫病毒的能力得到加強，避免免疫陷入混亂而導致免疫失敗的結果；2）銅仁市的養豬場規模不大，針對豬口蹄疫的防范意識薄弱，相關的技術人員也不健全，且對豬口蹄疫的重視程度不高，使得疫苗免疫的方式或操作不規范，免疫效果相應的也就降低；3）是疫苗質量不過關，運輸與儲藏不當而引起的疫苗失效[16]。2013年熊勝利等采用正向間接血凝試驗對貴州省某規模場豬場O型口蹄疫春秋兩防免疫抗體監測及野毒檢測顯示不同地區的抗體監測結果，一些散養戶的免疫合格率較低，針對免疫合格率低的地區，需要加強免疫[17]，如春季中出現松桃縣（68.33%）、德江縣（67.50%）兩個縣免疫合格率未達到農業部的標準，而秋季監測的各個地區都達到農業部規定的標準，此情況說明在春季的基礎差各地區的豬O型口蹄疫免疫情況有所改善，但對于免疫合格率較低的地區，銅仁市的養豬場應該確立完善的免疫監管制度，且根據檢測的大部分地區雖然合格率雖達到農業部規定的標準，但大部分地區都未達到100%的合格率，對這些地區也應該建議實施強化免疫[18]。并且在科學飼養管理的基礎上，銅仁地區規模場要建立健全防疫衛生制度，制定科學、規范、具有針對性的本地免疫程序，提高免疫效果[19]。

3.5 不同階段的豬O型口蹄疫抗體水平，哺乳仔豬抗體水平明顯較低

對不同類型豬O型口蹄疫抗體水平結果分析，得出對兩次檢測的血清樣品中春季公豬、母豬、育肥豬、保育豬、哺乳仔豬陽性率分別是94.23%、77.78%、72.22%、70.08%、56.20%。秋季母豬、育肥豬、公豬、保育豬、哺乳仔豬陽性率分別是95.56%、89.81%、88.46%、74.35%、60.33%。春、秋兩次檢測哺乳仔豬的陽性率都比較低，這與張智鵬等在漢中地區免疫抗體與結果分析中報道不同階段豬O型口蹄疫抗體仔豬免疫合格率80.15%的結論不一致，而檢測的結果顯示春季哺乳仔豬的陽性率56.20%，秋季哺乳仔豬的陽性60.33%，哺乳仔豬免疫因受母源抗體的干擾，就很容易造成免疫失敗，到了保育階段或育肥階段，若不及時了解抗體水平進行補免，再加上環境消毒不徹底，就極易造成口蹄疫病毒的感染，因此應該落實每一個階段生豬的免疫工作，齊向濤等采用ELISA法對分別采集自北疆地區3個規模化豬場公豬、后備母豬、哺乳母豬、仔豬等不同階段豬群的血清進行豬O型口蹄疫檢測，結果顯示，仔豬的陽性率就比較低，針對這一情況提出建議：30日齡之前的仔豬母源抗體依然較高，此時接種會造成免疫抑制，所以此階段不能進行首次免疫，應該把首次免疫的時間推至40日齡，這樣抗體水平不至于太低[20]。

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