山河陳醋大曲淀粉酶系分析

李中正，曹彥軍，呂玉柱， 郝林*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷　030801；2.山河醋業(yè)有限公司，山西 和順　032700)

大曲是山西陳醋生產(chǎn)中的重要糖化發(fā)酵劑，大曲質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到陳醋的出醋率和質(zhì)量，大曲中各種淀粉酶含量及活力是大曲質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)方面，檢測(cè)分析大曲中各種淀粉酶含量及活力，對(duì)于保證陳醋正常生產(chǎn)及品質(zhì)具有非常重要的意義。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱,是一類用途十分廣泛的酶,在食品工業(yè)、紡織工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)都經(jīng)常使用。淀粉酶主要可以分為四大類[1]：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶[2]和淀粉脫支酶。

目前，對(duì)于大曲淀粉酶系的研究大多數(shù)集中在α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶(糖化酶)，而對(duì)淀粉脫支酶的研究報(bào)道很少。增加對(duì)大曲中淀粉脫支酶的研究，對(duì)全面分析評(píng)價(jià)大曲中淀粉酶系的性能和質(zhì)量十分重要。

淀粉脫支酶又稱異淀粉酶[3]，它可以水解糖原、支鏈淀粉和β-極限糊精中α-1，6糖苷鍵，對(duì)α-極限糊精具有部分水解作用，淀粉脫支酶在淀粉加工工業(yè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，以葡萄糖的生產(chǎn)為例，單獨(dú)使用糖化酶，底物濃度34%時(shí)，葡萄糖值最大為95.5%，若要進(jìn)一步提高葡萄糖值，需要降低底物濃度；而利用脫支酶與糖化酶協(xié)同作用，在相同底物濃度下，葡萄糖值可以達(dá)到97.0%，原料利用率提高0.3%～0.5%，并且反應(yīng)時(shí)間縮短15%，糖化酶用量減少15%，每年可節(jié)省淀粉原料3萬(wàn)余噸[4]。

醋廠的原料淀粉先要經(jīng)過(guò)液化，再用糖化酶進(jìn)行糖化。糖化酶對(duì)α-1，6葡萄糖苷鍵水解速率較低，為了提高對(duì)淀粉分支鍵的水解效率，往往需要添加過(guò)量的糖化酶。糖化酶添加過(guò)多時(shí)，可以催化葡萄糖發(fā)生聚合反應(yīng)，生成異麥芽糖，導(dǎo)致最終葡萄糖產(chǎn)量下降。當(dāng)在糖化過(guò)程中加入淀粉脫支酶時(shí)，淀粉脫支酶能與糖化酶協(xié)同作用，可以快速地切割α-1，6葡萄糖苷鍵，減少糖化酶的用量，減少副反應(yīng)的發(fā)生；提高淀粉的利用率，縮短糖化時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。

本研究對(duì)山河陳醋大曲及大曲中分離出的糖化菌株進(jìn)行淀粉酶系的分析研究，為下一步大曲的強(qiáng)化奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

大曲:取自山河醋業(yè)有限公司制曲廠房；菌種：分離自山河陳醋大曲。

3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、可溶性淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉(支鏈淀粉)、醋酸鈉、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、碘、碘化鉀(均為分析純)：天津歐博凱化工有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

FW80微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；KLO4A離心機(jī)湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；雙列六孔恒溫振蕩水浴鍋上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3　方法

1.3.1α-淀粉酶、β-淀粉酶活力的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定[5,6]。

1.3.2葡萄糖淀粉酶(糖化酶)活力的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色定糖法測(cè)定[7,8]。

1.3.3淀粉脫支酶(異淀粉酶)活力的測(cè)定

1.3.3.1酶活測(cè)定原理

由于線性葡聚糖與碘的結(jié)合能力比分支葡聚糖(支鏈淀粉)要強(qiáng)很多，淀粉脫支過(guò)程中與碘的結(jié)合增強(qiáng)，從而顯示更強(qiáng)的藍(lán)色[9-11]。

1.3.3.2測(cè)定步驟

吸取0.5 mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的粗酶液，加入到含有3 mL 0.833%支鏈淀粉底物的18 mm×18 cm 試管中，50 ℃孵育30 min。30 min后取出0.5 mL反應(yīng)液加入到含有0.5 mL碘液的試管中。然后迅速加入15 mL稀硫酸溶液，混勻。室溫放置10 min，然后在610 nm下測(cè)定吸光度[12]。

2　結(jié)果與分析

2.1　α-淀粉酶活力的測(cè)定結(jié)果

山河陳醋大曲和12株菌株的α-淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的α-淀粉酶活力Fig.1 Activity of α-amylase from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖1可知，各菌株酶活力在0.303～6.238 U/g，M4，M17酶活力較高，均達(dá)到了5 U/g以上，X5在細(xì)菌中的酶活力最高，為4.006 U/g，X17的酶活力最低，其他幾株的酶活力相差在3 U/g以內(nèi)，山河大曲的α-淀粉酶活力只有1.540 U/g，添加優(yōu)勢(shì)菌株麩曲強(qiáng)化山河大曲[13]，可以提高山河大曲的α-淀粉酶活力。

2.2　β-淀粉酶活力的測(cè)定結(jié)果

山河大曲和12株菌株的β-淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)圖2。

圖2　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的β-淀粉酶活力Fig.2 Activity of β-amylase from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖2可知，各菌株的酶活力在15.973～234.664 U/g，差異較大，細(xì)菌的酶活力普遍不高，均在50 U/g之下，M13的活力最高，為234.664 U/g，另外，大曲的酶活力為215.622 U/g，和M13的酶活力差異很小，不需要專門強(qiáng)化。

2.3　葡萄糖淀粉酶活力的測(cè)定結(jié)果

山河大曲和12株菌株的葡萄糖淀粉酶活力的測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)圖3。

圖3　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的葡萄糖淀粉酶活力Fig.3 Activity of glucose amylase from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖3可知，各菌株的酶活力在384.970～1204.368 U/g，M17，M4，M13的菌株酶活力較高，M13的酶活力最高，為1204.368 U/g，酶活力在800 U/g及以上的菌株有5株，山河大曲的酶活力為816.815 U/g，和M13菌株的酶活力有一定差距，可以添加M13麩曲強(qiáng)化山河大曲，適當(dāng)提高葡萄糖淀粉酶活力。

2.4　淀粉脫支酶的測(cè)定結(jié)果

山河大曲和12株菌株的淀粉脫支酶的測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)圖4。

圖4　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的淀粉脫支酶活力Fig.4 Activity of debranching enzyme from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖4可知，酶活力在0.031～0.101 U/g，差異不大且普遍很低，在0.07 U/g左右的有5株菌株，M13酶活力最高，為 0.101 U/g。

將以上所有菌株及大曲各自的4種酶活力歸納成表1。

表1　淀粉酶系活力測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of amylase activity determination

續(xù)　表

由表1可知，山河大曲的α-淀粉酶活力為1.540 U/g，β-淀粉酶活力為215.622 U/g，葡萄糖淀粉酶活力為816.815 U/g，淀粉脫支酶活力為0.073 U/g。其中山河大曲的α-淀粉酶活力和淀粉脫支酶活力明顯不高，這會(huì)導(dǎo)致原料淀粉糖化不充分，糖化速度慢，可發(fā)酵性糖的轉(zhuǎn)化率低，最終造成生產(chǎn)出醋率低，生產(chǎn)效益差的結(jié)果。針對(duì)山河大曲淀粉酶系的不足，可以選用本研究中綜合表現(xiàn)優(yōu)秀的M4和M13菌株制成麩曲，強(qiáng)化山河大曲，以達(dá)到提高生產(chǎn)出醋率，提高生產(chǎn)效益的目的。

3　結(jié)論

山河大曲中淀粉脫支酶的酶活力M13最高，為0.101 U/g，國(guó)內(nèi)對(duì)淀粉脫支酶的報(bào)道也有一些。其中，王武等[14]首先在1993年篩選得到1株產(chǎn)異淀粉酶的短桿菌BI25164，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化酶活力達(dá)到0.520 U/g，段緒果等在2013年通過(guò)PCR克隆得到異淀粉酶編碼基因，構(gòu)建得到產(chǎn)重組異淀粉酶的大腸桿菌，酶活力達(dá)到0.879 U/g。在后續(xù)的研究中，可以采用基因的重組表達(dá)和分子改造的方法[15]，提高淀粉脫支酶的酶活力，以期達(dá)到更加理想的效果。

淀粉酶系活力是大曲的重要指標(biāo)，也是衡量大曲質(zhì)量的指標(biāo)，在山河醋業(yè)原有的陳醋生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，添加適量的由M4和M13菌株制成的麩曲，強(qiáng)化原有大曲進(jìn)行陳醋生產(chǎn)，可以在最大限度保持山河陳醋原有感官質(zhì)量的基礎(chǔ)上，提高原料出品率，對(duì)提高醋廠的經(jīng)濟(jì)效益有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]童海寶.生物化工[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2001：51-54.

[2]張劍，林庭龍，秦瑛，等.β-淀粉酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)釀造，2009,28(4)：5-8.

[3]吳敬.異淀粉酶的重組表達(dá)及在環(huán)糊精制備中的應(yīng)用[C].華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)交流會(huì).徐州：2012.

[4]段緒果.微生物GH13家族淀粉脫支酶研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)報(bào)，2013，53(7)：648-656.

[5]朱廣廉,鐘誨文,張愛(ài)琴.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:北京大學(xué)出版社,1990：175-178.

[6]馬永強(qiáng),韓春然，方蕾，等.玉米萌發(fā)過(guò)程中淀粉酶性質(zhì)的研究[J].食品科學(xué)，2007，28(11)：294-297.

[7]GB 1886.174-2016，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑[S].

[8]馬耀紅.大曲糖化力的快速測(cè)定方法[J].中國(guó)釀造，2014，33(3)：129-131.

[9]Abe J,Ushijiamashi C,Hizukuri S.Expression of the isoamylase gene ofFlavobacteriumodoratumKu inEscherichiacoliand identification of essential residues of the enzyme by sitedirected mutagenesis[J].Appl and Environ Microbiol,1999,65(9):4163-4170.

[10]Takahashi K,Abe J,Kozuma T,et al.Production and application of an isoamylase fromFlavobacteriumodoratum[J].Enzyme Microb Tech,1996,19(6):456-461.

[11]Fang T Y,Tseng W C,Yu C J,et al.Characterization of the themophilic isoamylase from the themophilic archaeonSulfolobussolfataricusATCC 35092[J].J Mol Catal B-enzym,2005,33(3):99-107.

[12]段緒果.淀粉脫支酶的重組表達(dá)及分子改造[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2013.

[13]宋克偉，胡建華，魏金旺，等.米根霉在牛欄山基酒生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].釀酒科技，2015(2)：73-75.

[14]王武，周曉宏.短桿菌異淀粉酶產(chǎn)生菌選育及酶作用性質(zhì)研究[J].無(wú)錫輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，12(3):197-204.

[15]江民華，林厚民，尹金陽(yáng)，等.差異檸檬酸桿菌GXW-1 β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及分子改造[J].微生物學(xué)報(bào)，2017，57(3)：363-374.