頂空固相微萃取法對兩種大豆發酵豆豉揮發性成分的比較

謝蘭心，樊曉博

(渭南職業技術學院，陜西 渭南　714000)

豆豉，我國古代稱之為“幽菽”，是一種以黃豆或黑豆為原材料，經細菌或霉菌發酵而成的調味品,有著悠久的歷史[1]。在我國不同的地區，豆豉的制作方法各有特色。依據發酵優勢菌群的不同，豆豉被分為霉菌型和細菌型；按加工原材料的不同，可分為黑豆豆豉和黃豆豆豉；根據加工過程是否添加食鹽，可分為淡豆豉和咸豆豉。作為傳統發酵豆制品，豆豉富含蛋白質和各種氨基酸，營養豐富，味道鮮美[2]，且含有人體所需的多種維生素和礦物質,具有一定的保健作用[3]，廣受我國人民群眾的喜愛。

不僅在我國，亞洲其他地區也有發酵豆制品的身影，如日本的納豆和東南亞的天培。然而，這兩者的發展現狀和世界范圍內的影響力已遠超豆豉。納豆不僅在日本廣受歡迎，而且已輻射到周邊國家。國外科學家研究發現，納豆不僅能夠抗癌，而且能起到一定的溶解血栓功能[5]；研究結果一經發布，納豆的發展勢頭更是令人矚目[4]。東南亞的天培則隨著印尼移民的足跡傳到了美洲、歐洲和非洲，科學家對其進行了深入的研究，發現天培具有良好的防癌、抗氧化功效，這使得天培躋身于世界高檔食品市場，身價倍增。反觀我國豆豉，雖然歷史悠久，營養豐富，但目前對它的研究僅有異黃酮和抗氧化功能2個方面，其他方面仍有待進一步研究。目前我國許多豆豉生產廠家仍采用傳統發酵工藝，生產規模和產品檔次均無法滿足消費者的需求，發展前景堪憂。

至于風味，目前在我國，已有人對細菌型豆豉的香味成分進行了分析[6]，但是，作為中國豆豉主流產品的霉菌型豆豉,其香味成分研究卻少見報道[7,8]。

為了研究原料豆經發酵后的理化性質改變，首先對原料豆(黑豆和黃豆)的各理化性質進行測定和對比，主要包括水分、蛋白質、脂肪和灰分等。以曲霉為主要菌種制作豆豉，只加入少量食鹽以保持豆豉的原味。至于風味物質的提取，采用了頂空固相微萃取法。并通過GC-MS聯用和氣相吸聞技術對2種豆豉的風味物質進行了鑒定和比較。最后，對成品豆豉的理化性質進行了比較。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1儀器

Agilent 6890N/5975MSD氣質聯用儀、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、DK-98-11A電熱恒溫水浴鍋、DZF-6021真空干燥箱、DHG-9123電熱恒溫鼓風干燥箱、分析天平、電子天平、DHG-9123電熱恒溫鼓風干燥箱、SP-752型UV-Vis分光光度計、電子萬用爐、DH3600B電熱恒溫培養箱、SHA-B恒溫振蕩器、手提式蒸汽滅菌鍋、通風櫥、打粉機、索氏提取器、微量凱氏定氮裝置。

1.1.2試劑

黑豆(black bean)、黃豆(soybean)、乙醚、濃硫酸、氫氧化鈉、二氯甲烷、正戊烷、鹽酸、硼酸、甲基紅、茚三酮、3,5-二硝基水楊酸，以上試劑均為分析純。

1.2　實驗方法

1.2.1理化指標的測定

1.2.1.1水分含量的測定

將黑豆、黃豆、黑豆豉和黃豆豉在粉碎機中打成粉末狀，取清潔干燥的干燥瓶，在分析天平上稱取干燥瓶重量并記錄，準確稱取2 g左右粉末于干燥瓶內，記錄樣品和瓶的重量，將樣品置于真空干燥箱內烘干12 h，烘干完成后精確稱干燥后樣品和瓶的重量并計算。

1.2.1.2凱氏定氮法測粗蛋白含量

稱取0.3 g左右樣品粉末于消化瓶中，采用凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白含量并記錄。

1.2.1.3脂肪含量的測定

用分析天平稱取2 g左右干燥樣品，索氏抽提法測定樣品脂肪含量并記錄。

1.2.1.4粗灰分的測定

將瓷坩堝置于馬福爐灼燒0.5 h，冷卻后精確稱量并記錄；稱取粉碎干燥后的2 g左右樣品，將樣品放入坩堝中，記錄質量。

將裝有樣品的坩堝放入馬福爐中，在500～600 ℃灼燒至無炭粒(即灰化完全)。冷卻到200 ℃以下時，移入干燥器中冷卻，待冷卻至室溫后稱量，重復灼燒至前后2次稱量差不超過0.5 mg為恒重。最后冷卻后精確稱量坩堝和總灰分的質量并計算。

1.2.1.5茚三酮法測豆豉中氨基酸的含量

配制茚三酮溶液；制作異亮氨酸標準曲線；樣品處理及測定：

稱取粉末狀樣品各5 g左右，并準確記錄；加入50 mL蒸餾水，放置于電爐上加熱煮沸，再無損地過濾至100 mL容量瓶中，用熱水洗滌殘渣數次，定容至100 mL；再吸取10 mL定容后的溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。取樣液加入現配的茚三酮溶液，搖勻后靜置15 min，在570 nm波長下比色，并記錄計算。

1.2.1.6總酸的測定

用已知濃度的鹽酸溶液標定氫氧化鈉溶液；測定方法：

稱取粉末狀樣品各5 g左右，并準確記錄；加入50 mL蒸餾水并煮沸，再無損過濾至100 mL容量瓶中，用熱水洗滌殘渣數次，后定容至100 mL；再吸取10 mL定容后溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。吸取20 mL樣品，滴入2滴酚酞，用已標定的氫氧化鈉溶液滴定至初顯粉色，即為終點。記錄消耗的氫氧化鈉溶液體積，據此計算樣品中總酸的含量。

1.2.1.73,5-二硝基水楊酸法測定還原糖(DNS法)

制作葡萄糖溶液標準曲線；樣品處理及測定：

稱取豆豉樣品3 g左右，并準確記錄，加入50 mL蒸餾水于50 ℃水浴20 min，多次過濾洗滌，并定容至100 mL，取樣液加入3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)并搖勻，沸水浴5 min，取出后立即放入涼水中冷卻至室溫，定容至25 mL，在540 nm波長下比色并記錄。

1.2.1.8碳水化合物的測定

采用差值法，按下式計算：

碳水化合物(%)=100%-(水分+蛋白質+脂肪+灰分)%。

1.2.2豆豉揮發性成分鑒定

1.2.2.1頂空固相微萃取法(SPME)提取豆豉中風味物質

在頂空瓶底部加入1粒轉子，稱取5 g粉碎樣品置于20 mL鉗口瓶中，加入20 mL蒸餾水，用聚四氟乙烯隔墊密封,于磁力攪拌器上在60 ℃加熱平衡15 min后,通過隔墊插入已活化好的SPME萃取頭(270 ℃活化30 min),推出纖維頭,頂空吸附40 min后,插入GC進樣口解吸5 min。

1.2.2.2色譜條件和質譜條件

色譜條件：色譜柱為DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣：氦氣；柱流量：1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃，不分流進樣；起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃,再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。

質譜條件:接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；離子化方式EI；電子能量70 eV，質量范圍35～350 amu。

1.2.2.3化合物鑒定及定量

樣品的揮發性化合物經氣相色譜分離，不同組分形成其各自的色譜峰，用氣相色譜-質譜(GC/MS)聯用儀進行分析鑒定。分析結果運用計算機譜庫(NIST/WILEY)進行初步檢索及資料分析。

2　結果與分析

2.1　原料豆理化指標

表1　黑豆和黃豆的理化指標　%

由表1可知，黑豆的粗蛋白含量和粗灰分略高于黃豆，而黃豆的脂肪、水分和碳水化合物含量略高于黑豆。

2.2　SPME法分析豆豉中揮發性成分

表2　豆豉揮發性成分經SPME提取后的GC-MS分析結果

續　表

由表2可知，2種不同的豆豉樣品經SPME方法、GC-MS分析后共檢測出9類、65種揮發性化合物。其中黃豆豉檢出酸類3種、醇類3種、酯類12種、醛類9種、酚類1種、雜環類3種、烴類6種、其他類1種，共38種揮發性化合物。黑豆豉檢出酸類6種、醇類1種、酯類4種、醛類6種、酮類2種、酚類2種、雜環類4種、烴類9種、其他類2種，共36種揮發性化合物。2種豆豉中各類揮發性化合物所占比例見圖1。

圖1　經SPME法提取的2種豆豉揮發性成分的比較

由圖1可知，黃豆豉中最主要的揮發性化合物是醛類，其次是醇類、酯類和烴類。而黑豆豉中最主要的揮發性物質也是醛類，但是酸類的百分含量在黑豆豉中也占了較大的比例。

經SPME法檢測，黃豆豉所得到的揮發性成分相對百分含量較高的有苯乙醛(10.5608%)、2，3-丁二醇(6.0176%)、苯乙烯(4.9051%)、苯甲醛(4.588%)、乙酸(2.194%)、γ-壬內酯(1.9923%)、小茴香醛(1.8813%)、3-甲硫基丙醛(1.5833%)、乙基香蘭素(1.5379%)、十四酸乙酯(1.3875%)、壬醛(1.158%)和γ-十一內酯(1.0658%)。

經SPME法檢測，黑豆豉所得到的揮發性成分相對百分含量較高的有3-甲基丁酸(12.1981%)、苯乙醛(6.9729%)、反-2-庚烯醛(6.5372%)、D-檸檬烯(6.1124%)、苯甲醛(4.1037%)、庚烯酮(2.7924%)、反-2-辛烯醛(2.5627%)、2-甲基己酸(2.5563%)、辛烯酮(2.2062%)、2-甲基丁酸(1.6304%)和丁酸(1.6%)。

比較2種樣品所檢測出的結果，2種樣品均有的揮發性物質只有丙酸、苯乙醇、十四酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、4-乙烯基愈創木酚和檸檬烯。經氣相吸聞法分析，其中，苯乙醇具有特有的玫瑰花的香氣；苯甲醛具有較濃重的苦杏仁氣味和焦味；苯乙醛氣味香甜，有玫瑰花香及些許發酵韻味；壬醛有類似玫瑰花的香氣；丙醛具有類似甜香、柑橘香、蠟香、花香的氣味，這些物質可能對豆豉的風味有一定影響。

經SPME檢測，黃豆豉特有的揮發性化合物有γ-壬內酯、γ-十一內酯、小茴香醛和乙基香蘭素等。其中，γ-壬內酯具有椰子型香氣，略帶茴香香韻，稀釋后有杏、李子香氣；γ-十一內酯又稱桃醛，具有桃子、椰子、堅果、奶油、香子蘭的氣味；乙基香蘭素具有類似香莢蘭豆的香氣，這些都可能對黃豆豉的風味做出貢獻。而黑豆豉中特有的揮發性成分有1-辛烯-3-酮、1-庚烯-3-酮、反-2-庚烯醛和反-2-辛烯醛等。其中1-辛烯-3-酮具有蘑菇類氣味；反-2-庚烯醛具有油脂香和果香；反-2-辛烯醛具有新鮮的黃瓜、清香的藥草氣息。

2.3　豆豉理化指標

經汪立軍等[9]的研究，豆豉中的風味物質主要來源于大豆營養物質經微生物酶水解后生成的各種次級產物和小分子終產物。如蛋白質水解生成多肽、氨基酸，其中谷氨酸、天門冬氨酸具有鮮味，而酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氧化后可生成黑色素；淀粉經酶水解生成糊精和麥芽糖，最終生成葡萄糖；葡萄糖經微生物酶水解又可生成乙醇、乙醛、乙酸、乳酸等多種小分子產物；而脂肪水解成甘油和脂肪酸，其中脂肪酸又是構成酯類的來源之一。這些次級產物和小分子物質有的本身具有香氣，有的可以與其他物質作用生成色素、酯類等香氣成分。

對2種豆豉理化指標進行的比較見表3。

表3　2種豆豉的理化指標

比較發現，黃豆豉的蛋白和氨基酸含量都高于黑豆豉，而黑豆豉的總酸和還原糖含量都高于黃豆豉。這些主要成分含量的差異可能是2種豆豉口味不同的原因之一。

3　結論

3.1　SPME法所得到的揮發性物質總結

采用固相微萃取方法對2種大豆豆豉進行鑒定，黃豆豉共鑒定出38種揮發性化合物，其中酸類3種、醇類3種、酯類12種、醛類9種、酚類1種、雜環類3種、烴類6種、其他類1種；黑豆豉共鑒定出37種揮發性化合物，其中酸類6種、醇類1種、酯類4種、醛類6種、酮類2種、酚類2種、雜環類4種、烴類10種、其他類2種。2種豆豉共同檢出的豆豉主要香氣成分有：苯乙醇、十四酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、4-乙烯基愈創木酚和檸檬烯。

3.2　2種豆豉特征風味物質總結

3.2.1黃豆豉中特征風味物質

丁內酯、γ-壬內酯、γ-十一內酯、丁酸丁酯、丁二酸二乙酯、香蘭素、乙基香蘭素、吲哚、吲哚嗪、香豆素等。

3.2.2黑豆豉中特征風味物質

5-辛內酯、1-辛烯-3-酮、1-庚烯-3-酮、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛等。

可見2種豆豉具有不同的揮發性風味成分，2種豆豉的理化指標也有差異，這也是賦予2種豆豉不同感官風味的原因。

3.3　今后實驗方向

實驗室中常用的風味萃取方法有3種，一種是本文所用的SPME(頂空固相微萃取法)，此外還有同時蒸餾萃取(SDE)和固液萃取(S-L)法。在后面的實驗中可以采用3種方法分別對黑豆豉和黃豆豉的揮發性風味成分進行測定，比較3種萃取方法的優劣，并根據結果選取更為合適的萃取方法。同時也可采用感官評定方法對2種豆豉的感官風味做評定。

參考文獻：

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[9]汪立軍．曲霉型豆豉發酵特性及風味物質研究[D]．北京：中國農業大學，2006.