葡萄球菌和微球菌對廣式臘腸風味的影響

鄭培君，程海濤，齊明

(1.佛山職業技術學院，廣東 佛山　528137；2.廣豐區農業局，江西 上饒　334600)

廣式臘腸是嶺南地區傳統風味特色食品，因其咸中帶甜、酒香醇厚的獨特風味深受廣大消費者喜愛。龍卓珊等利用固相微萃取結合嗅覺檢測法鑒定出13種廣式臘腸特征風味化合物，包括4種醛、8種酯和1種酮[1]。Du M和Ahn D U利用頂空氣質聯用方法測定其風味物質成分主要有醇類、酯類、醛類和酮類物質，還有部分烴類和環類化合物[2]。這些風味物質主要來源于輔料、非微生物直接參與的生化反應(包括糖降解、蛋白質水解、脂肪氧化、 Strecker降解、Maillard反應等)以及微生物酶降解脂類、蛋白質和碳水化合物形成的風味物質。其中微生物對風味物質成分形成的重要作用早就被人們意識到，直達近十多年來，關于發酵劑對產品風味物質成分的影響才有更深入的研究[3-5]。Berdagué在1993年首先提出，葡萄球菌對于干香腸芳香氣味的形成具有優勢作用[6]。微球菌和葡萄球菌在發酵和成熟過程中能夠產生降解蛋白質和脂肪的酶，酶解的產物在干發酵香腸特征風味形成中起了重要作用[7]。Montel等研究也發現，葡萄球菌屬的微生物和肉中自身脂酶共同作用，參與了脂肪的降解過程，對香腸中脂肪酸的釋放產生了一定的影響，大量的脂肪酸釋放出來，進一步轉化形成了甲基酮和醛，為肉制品提供了獨特的風味[8]。本研究將分離自臘腸中的葡萄球菌和微球菌用于廣式臘腸的發酵生產，接種量為106cfu/g，采用固相微萃取與氣質聯用的方法對臘腸中的風味物質成分進行測定，分析接種分離菌株對廣式臘腸風味的影響。

1　材料

1.1　菌種

使用菌株均由本研究室分離并保藏，葡萄球菌編號為H33B，微球菌編號為X142B。

1.2　材料與試劑

豬后臀肉、豬背膘、白砂糖、鹽、白酒、雞精、味精，均購于當地超市；試驗中所用試劑，均為國產分析純試劑。

1.3　儀器與設備

SZ-22A型絞肉機、ZX-5L型手搖灌腸機廣州旭眾食品機械有限公司；101-3A型數顯電熱鼓風干燥箱上海雷韻試驗儀器制造有限公司； ZHJH-1112超凈工作臺、SPX-450生化培養箱上海新苗醫療器械制造公司；YX-280高壓滅菌鍋合肥華泰醫療設備有限公司；QYC-2102C搖床上海福瑪實驗設備有限公司；Trace-MS氣相色譜-質譜聯用儀美國Finnigan公司；65 μm DVB-PDMS萃取頭美國Supelco公司。

2　方法

2.1　菌株的活化和接種數量的確定

將保藏菌株吸取50 μL的原菌液接入到含MSA液體培養基中活化2次測OD值。然后根據稀釋平板法事先做好每株菌種的OD值和其活菌落總數的曲線關系圖和曲線方程，算出的OD值所對應的菌落總數。最后，菌體的濃度用無菌水調節至所需的濃度，待用[9]。

2.2　廣式臘腸加工工藝

2.2.1臘腸配方

肥肉和瘦肉之比為3∶7，背脂切成0.6 cm×0.6 cm小丁，其他輔料按肉的質量添加，食鹽2%，糖13%，酒2%，亞硝酸鈉0.15%，水20%。菌株的接種量為106cfu/g。

2.2.2烘烤參數

分為3個階段：0～12 h 55 ℃(降溫通風8 h)； 50 ℃ 16 h(降溫通風8 h)；45 ℃ 24 h。

2.2.3對照組

僅添加150 mg/kg的亞硝酸鹽，不添加微生物。

2.2.4H+X組

添加106cfu/g的葡萄球菌H33B和微球菌X142B(1∶1)及150 mg/kg的亞硝酸鹽。

2.3　風味成分的分析

2.3.1頂空固相微萃取(HS-SPME)法

固相微萃取頭的老化：65 μm DVB-PDMS萃取頭在氣相色譜進樣口220 ℃老化4 h。

采用HS-SPME法對廣式臘腸揮發性成分的萃取。方法如下：臘腸樣品用小型食品攪拌機絞碎均勻后，迅速取60 g置于20 mL萃取瓶中，萃取頭插入萃取瓶并推出吸附纖維頭(不能接觸樣品)，60 ℃恒溫吸附30 min，然后縮回纖維頭，將針管退出樣品瓶，隨后插入氣相色譜儀進樣口220 ℃解吸3 min。

2.3.2色譜條件

利用氣/質(GC/MS)聯用儀(Trace GC/MS，Finnigan)進行風味成分分析。氣相色譜條件為：毛細管柱：DB-1柱(30 m×0.32 mm；液膜厚度1 μm)；柱溫升溫程序：起始溫度45 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min的升溫速率升溫到80 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的升溫速率升溫到180 ℃，保持4 min；汽化室溫度為220 ℃，載氣為He，流速為1.0 mL/min，進樣方式：按分流比10∶1進樣。

2.3.3質譜條件

質譜條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，燈絲發射電流200 μA，檢測器電壓為350 V，離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，掃描質量范圍35～395 amu。

2.3.4風味成分的鑒定

實驗數據處理由Xcalibur軟件完成，未知化合物經計算機檢索的同時與NIST譜庫(107000個化合物的數據)和Wiley譜庫(320000個化合物的數據，Version 6.0)相匹配，只有當正反匹配度均大于800(最大值為1000)的鑒定結果才予以確認。同時利用Willey和NIST譜圖庫工作站數據處理系統按峰面積歸一化法進行定量分析，求得各化學成分在廣式臘腸揮發性風味物質中的相對百分含量。

3　結果與討論

本試驗中我們采用頂空固相微萃取的方法提取臘腸中的風味物質成分，然后利用氣質聯用儀對風味物質成分進行定性和定量分析，考慮到試驗的可行性我們只對臘腸成品的風味進行了分析。對照組廣式臘腸的GC/MS圖譜見圖1，H+X組廣式臘腸的GC/MS圖譜見圖2。

圖1　對照組廣式臘腸的GC/MS圖譜Fig.1 GC/MS chromatogram of control group of cantonese sausage

圖2　H+X組廣式臘腸的GC/MS圖譜Fig.2 GC/MS chromatogram of H+X group of cantonese sausage

所篩選微生物對風味的影響見表1和表2。

表2　接種菌種對廣式臘腸揮發性風味物質的影響Table 2 Effects of inoculation of two strains on the flavor compounds in cantonese sausage

續　表

續　表

由表1可知，所篩選菌株對廣式臘腸的揮發性風味物質有一定的影響，H+X組分離鑒定出廣式臘腸揮發性風味物質56種，比對照組多了18種。其中從對照組鑒定出3種醇類(42.22%)、14種酯類(31.81%)、10種醛類(22.19%)、8種烷烯烴及含氧衍生物類(2.91%)、1種芳香族及其衍生物類(0.66%)。從H+X組鑒定出5種醇類(7.69%)、21種酯類(76.96%)、10種醛類(9.76%)、5種酸類(1.97%)、2種酮類(0.12%)、5種烷烯烴及含氧衍生物類(0.62%)、5種芳香族及其衍生物類(1.65%)。結果表明接種葡萄球菌和微球菌可以產生更多種的酯類、醇類、醛類和酮類物質，顯著提高了酯類物質的含量。

3.1　接種分離菌對醇類物質的影響

在醇類物質中以乙醇(ethanol)的含量最高，不同處理組的乙醇(ethanol)含量各有不同，例如對照組臘腸的乙醇占其總揮發性物質的42.22%，而H+X臘腸只有其總揮發性成分的7.69%，除乙醇外(ethanol)，1-辛烯-3-醇(1-okten-3-ol)是兩組臘腸中共有的醇類物質，而異戊醇(3-Methyl-1-butanol)、2-硝基乙醇(2-nitro-Ethanol)、正庚醇(n-heptanol)、正辛醇(1-Octanol)只能在個別的臘腸中檢測出來。醇類有清香、木香、脂肪香等香氣特征[10]，而且沸點低、揮發性好，可能對臘腸表香有一定的貢獻。另外醇類物質跟酸類物質結合生成酯類物質，對臘腸部分酯類物質的形成提供條件。許鵬麗[11]研究發現優級臘腸揮發物質中乙醇占總揮發物的62.18%，一級臘腸的揮發物中乙醇占64.03%。廣式臘腸加工過程會加入2%(質量比)的白酒，Sun等[12]也認為酯類和醇類是廣式臘腸的主要風味物質。

3.2　接種分離菌株對酯類物質的影響

在所檢測酯類物質中，不同處理組臘腸酯類物質種類和含量差別很大。對照組的酯類物質主要以辛酸乙酯(Ethyl caprylate)和葵酸乙酯(Ethyl caprate)為主，分別占其總揮發性物質的11.01%和8.51%；H+X組臘腸的酯類物質主要以乙酸乙酯(Heptanoic acid, ethyl ester)和異戊酸乙酯(Ethyl isovalerate)為主，分別占總揮發性物質的35.31%和18.56%。辛酸乙酯有類似白蘭地的香氣，并有甜味；乙酸乙酯有甜果香，微帶果香的酒香；異戊酸乙酯有水果、葡萄酒、蘋果的氣味。結果表明分離菌株可以提高臘腸中酯類物質含量。酯類物質對于臘腸的特征性風味起重要的作用，可賦予臘腸果香和花香風味，由長鏈脂肪酸所形成的酯則會產生一種具有酯香特征的風味[13]。臘腸中的酯類揮發性成分主要是乙酯類化合物，它們主要是來自于微生物的酯化作用。臘腸成熟過程中糖發酵、脂肪水解和氨基酸的氧化作用產生的酸與醇之間發生酯化生成酯類物質[14]。

3.3　接種分離菌對醛類物質的影響

由表1可知，醛類物質在對照組中含量為 22.19%，H+X組中含9.76%，低于對照組。己醛(Hexanal)、庚醛(Heptanal)、2-庚烯醛(2-Heptenal)、辛醛(Octanal)和E-2-辛烯醛((E)-2-Octenal)、壬醛(1-Nonanal)、十六烷醛(Hexadecanal)是兩組臘腸中共有的醛類物質，其他5種物質只在個別產品中檢測到。鑒定出的醛類物質主要是直鏈的 5～9 個碳原子的醛類物質，Berdagué等人曾報道4～10個碳原子的直鏈醛是肉制品中對風味有著重要貢獻的醛。兩組中都是己醛和壬醛的含量最高，己醛是亞油酸氧化的產物，一定程度上代表著脂肪氧化的程度。所鑒定出的醛類物質主要是中等相對分子質量的醛類和較高的相對分子質量的醛類，主要賦予的風味是清香、奶油香、脂香和橘子皮香[15]，這些醛類也許對廣式臘腸的風味具有較大的貢獻。

3.4　接種菌株對酸類物質的影響

酸類物質在廣式臘腸中檢出種類很少，一共有5種，只在H+X組檢出，H+X組還含有0.18%的L-乳酸，這是由于接種微生物發酵產生的。這也說明酸類物質不是廣式臘腸的特征性風味物質。這也是廣式臘腸跟西式發酵腸不同的地方，西式發酵腸pH值較低，酸味較重。酸類物質能跟醇類結合生成酯類物質，對酯類物質的生成有一定的貢獻。

3.5　接種菌株對酮類物質的影響

酮類物質只在H+X組臘腸中檢出且含量僅為0.12%。多數的酮具有清香的氣味、或奶油味或果香味，由于酮類物質在廣式臘腸中的含量普遍較低，對風味貢獻不大。

3.6　接種菌株對其他揮發性物質的影響

烷烯烴類及含氧化合物在廣式臘腸中所占的比例一般在0.4%～2.91%范圍內，正十五烷(Pentadecane)、十六烷(Hexadecane)這兩種烴是兩組臘腸中共有的烴類物質。廣式臘腸中所檢測的烷烴類物質的碳鏈都比較長，主要是C13～C22。烯烴類物質在廣式臘腸檢出也極少。由于烴類物質的風味閾值比較高，對廣式臘腸的風味貢獻很小[16]。

芳香族類化合物在廣式臘腸中存在比較多的有苯乙醛(Phenylacetaldehyde)、苯甲酸乙酯(Ethyl benzoate)、苯乙醇(Phenethyl alcohol)和苯乙酸乙酯(Ethyl phenylacetate)，其他類的芳香族化合物只在個別臘腸中存在。芳香族化合物在廣式臘腸中含量在0.26%～1.65%之間，這也說明芳香族類化合物對廣式臘腸中的風味貢獻也不大。芳香族化合物并不是來自肉制品本身，有可能來源于外界的污染，比如洗滌劑之類的污染，也有可能來自于臘腸包裝物中高分子物質的遷移[17]。

含氮類、含硫類、呋喃類、酰胺類等其他化合物在廣式臘腸中含量極少，固相靜態微萃取很難萃取到，所以檢測不出來。

4　結論

酯類物質是廣式臘腸風味中的特征性物質，酯類物質一般具有清甜而成熟的果香，同時還具有酒香的底韻，能掩蓋臘腸中肉的腥味，對臘腸的頭香有比較大的貢獻，給人一種非常愉快的酯香味，對臘腸的風味貢獻非常大。其次是醇類物質，這主要跟廣式臘腸制作時添加了酒有關。再次是醛類物質烷烯烴及其含氧衍生物類物質、芳香族類化合物和酮類物質，酸類和含硫類等其他類化合物含量和種類都極少。H+X組豐富了醇類、醛類和酮類物質，顯著提高酯類物質的種類和含量，改善了廣式臘腸的風味。接種組具有較好的風味是由于添加菌種后，在微生物酶和內源酶的作用下發生蛋白部分降解、脂肪降解和氧化，生成了更多的風味物質[18]。

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