Ⅱ型谷氨酰胺轉氨酶對缺氧骨肉瘤MG－63細胞凋亡的影響*

馬 薇，張書勤，魏 柏，豐小敏

（華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院腫瘤科，湖北 武漢 430077）

細胞Ⅱ型谷氨酰胺轉氨酶（transgiutaminase2，TG2）在缺氧刺激下可異常表達升高，并在腫瘤細胞的增殖、分化、轉移和凋亡過程中發揮重要作用[1]，有促凋亡和抗凋亡的雙重作用。王建新[2]采用HEK293細胞體外實驗發現，TG2抗凋亡機制可能與減少Bax產生，抑制Caspase－3和Caspase－9表達，降低細胞核內細胞色素C轉導入胞漿水平，以及鈣超載誘導線粒體膜的去極化過程等密切相關[2]。但其在骨肉瘤細胞中能否同樣發揮抗凋亡作用，以及具體的作用機制研究還較少。本研究中通過構建骨肉瘤細胞體外缺氧培養模型，探討缺氧條件下骨肉瘤MG－63細胞凋亡與TG2表達的關系，以及TG2抗凋亡機制與細胞色素C和Caspase－3表達的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑和主要儀器

骨肉瘤細胞株MG－63（中國科學研究院）；鼠抗人TG2，細胞色素 C，Caspase－3單克隆抗體（美國 San Cruze公司），AP堿磷酶標記抗小鼠IgG和過氧化物酶標記羊抗鼠IgG的二抗（北京中杉生物技術公司）；FAC Sort流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

細胞置含10%小牛血清的RPMI－1640培養液（美國Sigma公司）培養，在5%CO2、37℃及飽和濕度的培養箱中培養24 h，然后用0.25%胰酶消化、傳代。取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 缺氧模型構建

細胞置 CO2缺氧培養箱（5%CO2、95%N2）中、37 ℃下培養24 h。

1.2.3 分組與細胞轉染

取對數生長期細胞，重懸細胞濃度為5×105/孔接種至2 mL接孔板（美國Bio－Rad公司）中，待細胞長至90%以上時分為單純缺氧組和TG2 siRNA缺氧組，共培養 12 h。siRNA轉染：純化 siRNA分子由江蘇碧云天科技有限公司完成。TG2轉染組的siRNA序列為（F）5′－ GCGGGATCCGCCAGATCATTA － 3′，（R）5′－ TA CGCCCTUGGTGGCCUTGTU－3′。對照組 siRNA序列為（F）5′－ UATCGAGUACACTCAUGATCU － 3′，（R）5′－ UT GATGUCUUTAGTCCCTATU－3′。按照 Dharmafect 3試劑盒步驟進行轉染，進行下一步實驗。

1.2.4 觀察指標和檢測方法

微量滴定板法測定TG活性[1]：缺氧條件細胞培養12 h后，采用5－生物素酰氨基戊胺（BP，美國R＆D公司）標記。4℃、20 000 g超速離心10 min，使用細胞提取物包被96孔的微量滴定板（美國Bio－Rad公司）于4℃，含5%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBS）中封閉1 h。然后采用辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素（北京中杉生物技術公司）于37℃孵育45 min，PBS洗滌5 min×3次。微量滴定板中加入鄰苯二胺鹽酸鹽于室溫下顯色10 min，1 mol/L硫酸終止反應。顯色后采用微孔板分光光度計（美國GE公司）于490 nm波長處測量吸光度（A）值。實驗進行3次，取平均值。

RT－PCR法測定TG mRNA相對表達水平[2]：常規Tizol法（美國Santa Cruz公司）提取總RNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度，逆轉錄試劑盒（北京中杉生物技術公司）合成 cDNA，PCR擴增 TG2序列為（F）5′－GGGGTGAGAGAGGAAAGACC － 3′，（R）5′－ TGCAGTCTAGGGAGCTGGAT －3′，167 bp；內參 β －actin序列為（F）5′－TGACGTGGACATCCGCAAAG －3′，R：5′－CTGGA AGGTGGACAGCGAGG －3′，245 bp。反應參數為 94℃2 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35 個循環，72℃ 10 min終止反應。取擴增產物 10 μL用 1.2%瓊脂糖電泳鑒定產物，分析條帶灰度值，結果以2－△△Ct法表示。

Western Blot法[3]測定三酰甘油（TG）、細胞色素 C和Caspase－3蛋白水平：常規方法抽提細胞核和細胞漿總蛋白，考馬斯亮蘭蛋白定量測定濃度和純度。取適量樣本蛋白置十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，然后電轉移至硝酸纖維素膜上封閉，漂洗。分別加入鼠抗人TG2、Bax及cytC單克隆抗體一抗（北京中杉金橋生物有限公司，1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，再加入兔抗鼠多克隆抗體二抗（北京中杉金橋生物有限公司，1∶500），37℃避光孵育 1 h，麗春紅顯色，顯微鏡下觀察、拍照。

Sub－G1法檢測凋亡細胞[4]：胰酶消化，取 2×105個細胞，70%乙醇固定，4℃孵育過夜。PBS漂洗，溴化丙啶染色，1 h內于FAC Sort流式細胞儀上檢測。

1.3 統計學處理

2 結果

結果見表1和表2。單純缺氧組細胞凋亡率顯著低于 TG2 siRNA 缺氧組[（21.3 ±4.4）%vs（42.6 ±8.7）%，t＝ 5.758，P ＝ 0.031 ＜ 0.05]。

表1 兩組TG2活性、蛋白及mRNA水平比較()

表1 兩組TG2活性、蛋白及mRNA水平比較()

組別 胞核胞漿單純缺氧組TG2 siRNA缺氧組t值P值TG2活性26.4 ± 2.3 12.5 ± 2.2 4.518 0.036蛋白水平31.5 ± 3.4 13.6 ± 2.9 4.627 0.034 mRNA水平26.9 ± 2.1 10.3 ± 2.3 5.103 0.026 TG2活性11.6 ± 1.8 12.4 ± 1.7 0.529 0.127蛋白水平12.9 ± 2.7 12.6 ± 2.2 0.267 0.535 mRNA水平14.7 ± 1.9 14.5 ± 1.6 0.362 0.415

表2 兩組細胞色素C和Caspase－3蛋白水平比較()

表2 兩組細胞色素C和Caspase－3蛋白水平比較()

組別 胞核 胞漿單純缺氧組TG2 siRNA缺氧組t值P值細胞色素C 31.6 ± 2.5 13.5 ± 2.3 5.174 0.023 Caspase－3 26.7 ± 1.8 12.6 ± 1.5 4.926 0.035細胞色素C 5.6 ± 0.4 17.9 ± 2.1 6.517 0.014 Caspase－3 4.9 ± 0.6 16.6 ± 1.5 6.238 0.016

3 討論

TG2在胞漿、胞核、線粒體、細胞膜表面及細胞外基質中均有大量表達。TG2在Ca2＋依賴的催化蛋白交聯活性，三磷酸鳥苷（GTP）依賴的G蛋白功能，蛋白二硫鍵異構酶活性和蛋白激酶功能表達方面均發揮重要作用[3]。此外，TG2在多種惡性腫瘤細胞的生物學行為中扮演重要角色。但目前針對TG2在細胞凋亡中的作用仍無統一看法。部分研究認為，TG2主要表現促凋亡功能。缺氧條件下細胞表達一系列高水平活性氧簇（ROS），進而促使大量Ca2＋進入細胞內，胞漿內鈣超載，誘導TG2酶學活性增強，進而啟動細胞凋亡程序的發生[4]。也有研究指出，TG2高表達并不與凋亡程度一致。肺癌、結直腸癌、肝癌等數個惡性增殖腫瘤細胞系在體外誘導TG2過表達后，細胞凋亡率并未明顯增加[5]。Jang等[6]的研究證實，TG2發揮促凋亡作用可能與其水平有關，當TG2明顯消耗降低后可導致細胞周期停止而進入凋亡。藺會云等[7]研究指出，TG2表達升高可能促進腎癌細胞增殖，抑制凋亡。細胞核內聚集的TG2（R580A）可以抵消胞漿內TG2的促凋亡作用。因此，假設TG2在不同條件下可發揮促凋亡和抗凋亡雙重作用，其傾向哪一方及作用強弱可能與細胞類型、作用條件及TG2在細胞內的定位和構型等不同有關[8]。本研究結果顯示，缺氧條件下，胞核中TG2顯著增多，而胞漿中變化不明顯。TG2活性增強，mRNA和蛋白表達水平明顯增加，隨缺氧時間延長逐漸增高。單純缺氧組胞核中TG2活性、蛋白及mRNA水平均顯著高于TG2 siRNA缺氧組，差異有統計學意義，而胞漿中兩組比較，差異無統計學意義。提示缺氧條件下胞核中TG2的表達可能參與抗凋亡過程，而胞核中TG2更多地參與促凋亡過程。

骨肉瘤細胞凋亡途徑主要有2條，即死亡受體配體途徑和線粒體途徑。其中線粒體途徑是細胞內主要的凋亡機制，具體過程為細胞受胞內外各種凋亡刺激因子作用，誘導線粒體釋放細胞色素C，胞漿中細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子－1（Apaf－1）結合形成多聚體；進而趨化Caspase－9前體形成凋亡小體，Caspase－9激活后可進一步促進下游Caspase－3活化，加速凋亡進程[9]。Caspases－3是 Caspases家族介導細胞凋亡的關鍵分子，是各種凋亡途徑的終末效應分子。胞漿中無活性狀態的Caspases－3以酶原形式存在，凋亡啟動的早期階段即可被迅速、大量激活，活化狀態的Caspase－3結構組成有2個大亞基和2個小亞基，作用底物分布在胞漿和胞核中，通過多種效應分子介導的信號轉導途徑，最終誘導細胞凋亡[10]。胡岳等[11]研究證實，TG2在促凋亡過程中，同樣可以與細胞核、細胞質及線粒體內的一些蛋白形成非共價復合物，然后與Caspase－3形成不溶性復合物，進而抑制其活性，抑制凋亡進程的進一步擴大。其遏制凋亡發生及級聯擴增是不依賴TG2轉化酶功能，而可能與TG2的細胞定位與分子結構構象不同有關[12]。本研究結果提示，單純缺氧組Caspase－3活性水平無明顯增加，而siRNA轉染缺氧組通過直接抑制 TG2表達水平，導致 Caspase－3活性及其蛋白相對表達水平顯著升高，細胞凋亡率也隨之上升。由此說明，細胞缺氧狀態可誘導TG2的異常高表達，介導Caspase－3活性下降而發揮抗細胞凋亡表達[13]。

本研究中發現，單純缺氧組胞核中細胞色素C和Caspase－3蛋白水平顯著高于TG2 siRNA缺氧組，胞漿中含量及細胞凋亡率顯著低于TG2 siRNA缺氧組，提示缺氧條件下TG2可抑制骨肉瘤細胞色素C和Caspase－3由線粒體向胞漿內釋放，起到抗凋亡作用[14]。

綜上所述，缺氧條件下TG2高表達有抑制MG－63骨肉瘤細胞凋亡的作用，可能與抑制胞核中細胞色素C和Caspase－3向胞漿中轉移有關，可能成為治療骨肉瘤的新干預靶點。下一步研究可在動物模型中進行驗證。

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