高效液相色譜法測定單葉化香樹果序中沒食子酸含量*

劉金坤 ，應 敏 ，王 琴 ，敖 利 ，吳 斌 △

（1.重慶市中醫院中醫藥基礎研究室，重慶 400021； 2.重慶大學附屬腫瘤醫院，重慶 400030；3.重慶市中醫院藥劑科，重慶 400021）

化香樹 Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc.又名必栗香、燒為香、殺蟲魚（《本草綱目》）[1]，在我國分布廣泛，主要產于黃河流域及其以南地區，前期調查發現，陜西漢中地區秦嶺山地、四川廣元地區具有大量可利用資源。《中華本草》[2]《中藥大辭典》[3]記載，化香樹果序性溫、味辛，有清熱解毒、活血化瘀、清腫排膿、通竅止痛的功效。化香樹果序中含有糖及其苷類、酚類和鞣質、有機酸、黃酮類、生物堿、甾醇及三萜、蒽醌等化學成分[4－5]。揮發油成分中倍半萜化合物含量最多，具有殺菌、抗腫瘤、抗炎、止痛、消腫、清熱解毒等功效[6－7]，這與化香樹果序藥效基本一致。近年來，關于化香樹中沒食子酸的含量測定研究較少，而單葉化香樹果序的高效液相色譜（HPLC）分析方法尚無系統研究。為此，本研究中建立了HPLC法，以測定陜西漢中產單葉化香樹中沒食子酸含量，并對不同提取溶劑、不同波長條件下沒食子酸含量進行系統分析，為其資源開發提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（Agilent公司）；BT25S型電子天平（德國賽多利斯集團公司）；Thermo Pico17型離心機，Thermo Genepuer超純水儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Q－250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH－S11－2型電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）；TGL－16G型臺式高速離心機（上海醫用分析儀器廠）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為 110831－201605），鞣花酸對照品（批號為111959－201602），槲皮素對照品（批號為100081－201509)，均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸為優級純（購自Sigma公司）；試驗用水為純水儀制超純水，其他試劑均為分析純。化香樹樣品，2016年8月至12月采于陜西省漢中市略陽縣硤口驛鎮大院子村，經重慶市中醫院藥劑科敖利主任中藥師鑒定為胡桃科化香樹屬單葉化香樹果序，將采來的單葉化香樹果序樣品除去種子后粉碎，過80目篩，備用。

2 方法與結果

2.1 提取工藝考察

目前，化香樹果序的提取主要是針對其中所含多糖、黃酮類、多酚類等的有效部位和鞣花酸、沒食子酸等有效成分進行提取，主要選擇水、甲醇、55% ～70%乙醇為溶劑進行提取[8－10]，采用響應面法優化提取工藝。

本試驗中采用HPLC法測定單葉化香樹中沒食子酸含量，分別通過水、60%乙醇、95%乙醇提取，結果水提取物中沒食子酸含量最高，同時發現水提取、醇提取的圖譜峰有顯著性差異（見圖1）。說明提取溶劑不同，所得單葉化香樹果序提取物化學物質有很大差異，確定了單葉化香樹果序以水作為提取溶劑，與圓果化香樹果序的提取方法一致[11]。

圖1 未知成分不同溶劑、不同波長檢測的高效液相色譜圖

此外，取化香樹果序1.0 g，3份，各加入 50 mL純水、60%乙醇、95%乙醇提取，以甲醇－0.2%磷酸水溶液（55∶45）為流動相，發現在6.2 min時有一含量較高的峰，且以60%乙醇提取含量較高，254 nm波長處吸收較強，分別用沒食子酸、鞣花酸、槲皮素標定，結果均不符（見圖1），因此有待進一步深入研究。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Diamonsil?C18（2）柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇 －0.2% 磷酸水溶液（3 ∶97，18 ∶85，55 ∶45)；檢測波長：254，255，270，274 nm；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL /min。在此色譜條件下，沒食子酸[C6H2（OH）3COOH]的保留時間約為 11.1 min，詳見圖 2。

圖2 高效液相色譜檢測沒食子酸不同波長紫外吸收圖

2.2.2 溶液制備

對照品貯備液：稱取經干燥的沒食子酸對照品11.0 mg，精密稱定，用50%甲醇溶解并定容至 50 mL容量瓶中，得質量濃度為220 mg/L的對照品貯備液。

供試品溶液：稱取藥材粉末 3份，每份 1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入蒸餾水、60%乙醇、95%乙醇各50 mL，密塞，稱定質量，40℃ 超聲處理（300 W，40 kHz） 60 min，放冷，密塞，再稱定質量，用提取溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過，在離心機上以3000 r/min的速率離心5 min，精密量取續濾液5 mL置棕色容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取對照品貯備液5.000， 2.000， 1.000， 0.500， 0.250， 0.125 mL， 并 用50%甲醇稀釋定容至5 mL容量瓶中，搖勻，得質量濃度為 220.00，44.00，22.00，11.00，5.50，2.75 mg /L 的系列標準溶液，按 2.1項下色譜條件依次進樣 10 μL，測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝2 559.7X＋40.057，r＝0.999 8（n＝6）。結果表明，沒食子酸進樣量在 0.137 5～11.000 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取供試品溶液 10 μL，按2.1項下色譜條件重復進樣5次，測定沒食子酸峰面積。結果的 RSD為0.25%（n＝5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取單葉化香樹樣品，平行制備5份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算沒食子酸含量。結果的 RSD為0.18%（n＝5），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于 1，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣，測定峰面積。結果的RSD為0.74%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：稱取已知含量的單葉化香樹樣品5份，精密稱定，分別精密加入一定量的沒食子酸對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 水提單葉化香樹果序中沒食子酸加樣回收試驗結果(n＝5)

2.2.4 樣品含量測定

按供試品溶液制備方法制備待測溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，按外標法計算，對陜西漢中產單葉化香樹的果序中沒食子酸的含量進行分析。結果水、60%乙醇、95%乙醇提取的單葉化香樹果序中沒食子酸平均含量分別為 2.69，0.08，0.04 mg/g（n ＝5），色譜圖見圖 3。

3 討論

化香樹屬有單葉化香樹和圓果化香樹2種。單葉化香樹種分布于朝鮮、日本、我國各省區，常生長在海拔600～1 300 m，有時達2 200 m的向陽山坡及雜木林中，果序卵狀橢圓形至長橢圓狀圓柱形，長2.5～5.0 cm，直徑2～3 cm；葉總柄明顯較葉軸短；小葉7～23枚。圓果化香樹種為我國特有，主要分布于廣東、廣西、貴州，常生長于海拔450～800 m的山頂或林中；化香樹果序球狀，直徑 1.2～2.0 cm；葉總柄與葉軸近等長或較長；小葉 3～7枚[12]。

現代藥理學研究顯示，化香樹果序總酚和總黃酮類化合物對感染鼻炎、鼻竇炎的細菌有較強的抑制作用[13－15]。其中黃酮類化合物具有明顯清除人體內自由基、抗老化、抗突變等功能，且無毒；所含沒食子酸、鞣花酸和熊果酸具有抗氧化、抗癌和抗誘變活性的作用[16－18]。

流動相：前期研究中還考察了3種比例的流動相（甲醇 －0.2% 磷酸水溶液分別為 15 ∶85，5 ∶95，3 ∶97）對分離效果的影響，發現當甲醇－0.2%磷酸水溶液為3∶97時，沒食子酸與其他干擾峰完全分離，峰形對稱且尖銳，分離效果最好，故色譜條件中選用甲醇－0.2%磷酸水溶液（3∶97）為流動相。

圖3 單葉化香樹果序中沒食子酸含量測定高效液相色譜圖

檢測波長：選擇 254，270，273，274 nm 波長，發現沒食子酸在270 nm波長處有最大吸收，因此選擇270 nm作為檢測波長。

稀釋溶液：標準品和樣品的稀釋溶液曾選擇水、60%乙醇、95%乙醇、50%甲醇和甲醇分別溶解檢測，發現50%甲醇樣品雜峰干擾較少，且沒食子酸出峰時間約為 11.1 min，較為合適。

對比文獻[19]研究發現，不同地區化香樹果序中的沒食子酸含量具有明顯差異。化香樹樹皮、樹干、樹葉沒食子酸含量也不一致[11]。而本次采摘自秦巴山地區的單葉化香樹沒食子酸含量較高，具有重要的潛在藥用價值。

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