高效液相色譜法同時測定復(fù)方膽通片中5種蒽醌類成分含量

金賢武 ，付彩群 ，黃道明 ，黃 平 ，周興卓

（1.江西省上饒市食品藥品檢驗所，江西 上饒 334000； 2.江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，江西 上饒 334000；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000）

復(fù)方膽通片是由茵陳、膽通、穿心蓮、溪黃草和大黃5味中藥加工制成，具有清熱利膽、解痙止痛的功效，臨床主要用于治療膽囊炎、膽管炎、急慢性膽囊炎、肝硬化等[1]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下以膽通為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定[2]。目前，有研究在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加了溪黃草、膽通、大黃的薄層色譜鑒別，建立了測定羥甲基香豆素和齊墩果酸的高效液相色譜（HPLC）法[3]。也有研究以綠原酸、穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯、羥甲基香豆素等成分為指標(biāo)性成分[4－6]建立測定方法。鑒于處方中大黃的主要有效成分為蒽醌類化合物[7]，其具有較強(qiáng)的瀉下、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒等生物活性[8－11]，常作為藥材或制劑質(zhì)量控制及評價的指標(biāo)性成分，故本研究中以大黃的5種主要成分——蒽醌類成分為目標(biāo)成分，建立同時測定復(fù)方膽通片中該5種成分含量的高效液相色譜法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司)，包括 Waters e2489檢測器，Empower工作站；CPA225D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ－500DE型超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆薈大黃素對照品（批號為110796－201409，純度98.4% ），大黃酸對照品（批號為 110757 －201302，純度98.1% ），大黃素對照品（批號為 110756 －201211，純度99.2% ），大黃酚對照品（批號為 110796 －201410，純度98.7%），大黃素甲醚對照品（批號為 110766－201205，純度98.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方膽通片購自利群大藥房；色譜甲醇（德國Merck公司）；磷酸、分析甲醇（北京化工產(chǎn)品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomonex? －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －0.1% 磷酸水溶液（75 ∶25，V/V）；流速：1.0 mL /min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為 57.6，27.2，64.3，320.6，61.8 μg /mL的混合對照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液：取復(fù)方膽通片10片，去包衣，磨細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置 100 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，回流提取30 min，放冷，過濾，用甲醇洗滌濾紙和藥渣，至無色，合并濾液，蒸干，殘渣加2.5 mol/L硫酸溶液 10 mL，超聲 5 min后加三氯甲烷 10 mL，回流提取1.0 h，冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用CHCl3洗滌容器數(shù)次，合并洗液，取 CHCl3，酸液再用 10 mL CHCl3萃取3次，合并CHCl3液，揮去，殘渣加甲醇使其溶解，定容至10 mL，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：參照處方，取茵陳、膽通、穿心蓮、溪黃草4味中藥，按配方比例及供試品溶液制備方法制成缺大黃的陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.2項下3種溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖1?？梢姡?種被測成分能達(dá)到完全分離，陰性對照無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，5.0，10.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度。分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀分析，以峰面積(Y)對進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的 RSD分別為 1.62% ，2.01% ，1.31% ，0.75% ，1.59%(n ＝ 6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液（批號為140902），按 2.1 項下色譜條件分別于 0，2，4，6，8，12，24 h 時進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的 RSD分別為2.41%，1.17%，2.47% ，0.85% ，1.72%(n＝ 7)，表明 5 種成分在甲醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 5種成分線性回歸方程和線性范圍(n＝6)

表2 加樣回收試驗（n＝6）

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為140902）樣品，依法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計算 RSD。結(jié)果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的 RSD分別為0.97% ，1.49% ，2.35% ，1.56% ，1.04%(n ＝ 6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量（批號為140902）的樣品6份，每份約0.5 g，按1∶1的比例加入對照品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算回收率。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測定

取不同批次樣品約1.0 g，每個批次平行取3份，制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法計算含量。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取方法選擇

參照單因素考察法，試驗中比較了2種提取方法（超聲、回流），提取時間（30，45，60 min），提取溶劑（甲醇、乙醇），料液比（1 ∶10，1 ∶25，1 ∶50），結(jié)果顯示，以 25倍量的甲醇回流提取30 min后再水解提取5種蒽醌類成分所得含量最高。

3.2 水解條件選擇

蒽醌類成分易與糖結(jié)合，大部分以苷的形式存在。在測定時需先水解成苷元，結(jié)果顯示，采用2.5 mol/L硫酸的水解效果優(yōu)于8%的鹽酸[12]，故選用2.5 mol/L的硫酸水解后氯仿萃取的提取方法。

3.3 流動相選擇

試驗中比較了甲醇－水[13]，甲醇－0.1%磷酸水[14]和乙腈－0.1%磷酸水溶液[15]3種流動相。結(jié)果顯示，當(dāng)以甲醇 －0.1% 磷酸水溶液（75∶25，V/V）為流動相及洗脫程序時，5種蒽醌類成分均能與相鄰色譜峰完全分離，且峰形較好，可能是蒽醌類化合物大都具有酚羥基，顯弱酸性，在流動相中加入一定的酸可抑制其電離，從而改善峰形。

3.4 研究價值

復(fù)方膽通片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測定項以羥甲基香豆素為指標(biāo)成分，并未收入蒽醌類成分含量測定。有文獻(xiàn)以大黃素為指標(biāo)成分，建立了復(fù)方膽通片中大黃素的含量測定方法，但單一成分并不能完整地反映和保證藥物的療效和質(zhì)量，故本試驗中建立了復(fù)方中成藥大黃的5種蒽醌類成分含量測定方法，為以5種蒽醌類成分的總含量為含量測定要求的研究奠定了基礎(chǔ)。

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