泌尿系草酸鈣結石蛋白分析＊

葉韜 ，王義兵 ，劉偉 ，羅曉明 ，王共先 ，黃學明 ，劉偉鵬 ，習海波 ，余月 ，傅斌 ，

(1、江西省九江市第一人民醫院泌尿外科，九江 332000；2、南昌大學第二附屬醫院急診科，南昌 330006；3、江西省婦幼保健院藥劑科，南昌 330006；4、南昌大學第一附屬醫院泌尿外科，南昌 330006；5、江西省泌尿外科研究所，南昌 330006)

我國是泌尿系結石高發區之一，人群發病率高達1%-10%，其中25%患者需住院手術治療[1]。泌尿系結石復發率非常高，10年復發率為50%，15年復發率更是高達75%[2]。因此探討泌尿系結石的發病機制與防治方法具有重要意義。草酸鈣結石在尿石病患者中最為常見，其形成機制尚不明確。結石內蛋白成分在結石形成過程中可能有重要作用，而且與泌尿系感染密切相關。本項目通過研究草酸鈣結石蛋白成分特點，分析其與尿路感染最為常見的大腸桿菌的關系，旨在探索結石蛋白成分在結石形成中的作用與機制，進而為臨床防治提供依據。

1　材料和方法

1.1實驗材料隨機收集20例患者的尿路結石標本。同時收集相應患者的尿液標本。大腸桿菌通過參考大腸桿菌培養操作手冊進行培養獲得。

1.2實驗方法將收集到的結石樣本，經過清洗、晾干、充分碾磨。全部患者的尿液標本行尿常規分析及中段尿細菌培養。采用LIIR-20型號的結石紅外光譜分析系統分析結石的無機組成成分。利用本團隊的專利方法（專利號為ZL201510017515.7）提取結石內蛋白質。采用細菌蛋白質提取試劑盒提取大腸桿菌蛋白。采用Bradford法測定蛋白濃度。采用SDS-SPAGE電泳純化蛋白，銀染染色和考馬斯亮藍染色分別鑒定結石和大腸桿菌內蛋白分子量大小。經液相色譜儀和質譜儀鑒定蛋白質成份，對質譜結果進行Gene Ontology等生物功能信息分析。

2　結果

2.1結石無機成分20例結石樣本中有18例（90%）為草酸鈣結石，其中含一水草酸鈣成分的結石有17例；非草酸鈣結石2例，分別為二水磷酸氫鈣、碳酸磷灰石合并六水磷酸銨鎂。

2.2尿常規及中段尿培養6例患者尿常規結果正常。14例（70%）患者尿白細胞增多，提示有泌尿道感染可能。草酸鈣結石患者尿常規異常者13例（72%）。草酸鈣結石患者尿培養結果陽性1例（5%），培養結果為大腸埃希氏菌。

2.3結石蛋白與大腸桿菌蛋白濃度測定所有結石樣本均含有不同濃度的蛋白成分，草酸鈣結石平均蛋白濃度為0.57μg/μL，其標準曲線見圖1。合并感染的結石平均蛋白濃度為0.69μg/μL，非感染結石平均蛋白濃度為0.23μg/μL。采用t檢驗計算p值為0.01751，提示感染性結石和非感染結石濃度有顯著性差異。大腸桿菌蛋白濃度為5.38μg/μL。

圖1　尿蛋白濃度測定的標準曲線

2.4SDS-PAGE電泳草酸鈣結石內蛋白有3至4條蛋白帶，主要集中在25.0-35.0KDa和66.2-116.0KDa。相同成分結石條帶集中區域大致相同 （圖2）。大腸桿菌蛋白SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白成分主要集中在35.0KDa-116.0KDa，與草酸鈣結石有部分重疊（圖3）。

圖2　草酸鈣結石SDS-PAGE膠分離后行銀染染色（M為蛋白marker)

圖3　大腸桿菌蛋白SDS-PAGE膠分離后考馬斯亮藍染色結果（M為蛋白marker)

2.5草酸鈣結石蛋白質譜分析質譜結果共鑒定到88個蛋白，204個肽段。蛋白分子功能分析結果顯示48.8%為結合功能蛋白，19.58%為催化活性蛋白，31.62%為其他各類蛋白。蛋白生物學過程分析結果顯示8.14%的蛋白參與代謝，8.09%參與生物調控，10.34%和7.12%的蛋白分別參與細胞過程和應激。草酸鈣結石蛋白成分中多為結合功能蛋白，提示其在結石基質形成過程中可能起主要作用。尿常規陽性的草酸鈣結石與尿常規陰性的結石在質譜分析中結石蛋白成分無明顯差異。

3　討論

近年來，隨著經濟、環境與飲食結構等改變，我國泌尿系結石的發病率正逐年升高，尤其是南方地區更是嚴重，已嚴重影響了健康與社會經濟發展[3]。泌尿系結石主要包含草酸鈣結石、磷酸鹽結石、尿酸結石、胱氨酸結石等。其中以草酸鈣結石最為常見，約占80%以上[4]。本研究通過手術隨機收集的20例結石樣本中含草酸鈣成分的結石樣本有18例（90%），進一步驗證了草酸鈣結石的常見性。該類結石形成被認為主要與患者草酸和鈣代謝異常相關[5，6]。

臨床上泌尿系結石和尿路感染常合并存在，兩者可能為互促因素[7]。國內眾多研究發現革蘭氏陰性菌是泌尿系感染的主要致病菌，其中大腸埃希氏菌最為常見[8，9]。Kaneko等研究發現腎結石內含抗菌肽、溶菌酶等蛋白質[10]。抗菌肽與溶菌酶是細菌感染灶周圍相關的炎癥細胞所分泌[11]。據此可推斷泌尿系結石的形成與泌尿系細菌入侵有關，且結石內的蛋白質成份之一可能含有細菌蛋白質。本研究通過比對大腸埃希氏菌蛋白與草酸鈣結石蛋白條帶，發現兩者間存在重疊，草酸鈣結石的蛋白成分中可能含有大腸桿菌蛋白成分。

此外，本研究通過對草酸鈣結石進行質譜分析，發現草酸鈣腎結石內以結合功蛋白為主，其中包括炎癥相關蛋白 （纖維連接蛋白、角蛋白、S100A8和S100A9等）。而纖維蛋白、炎癥蛋白在草酸鈣結石中存在，提示炎癥與結石發病有一定聯系。事實上，近些年來研究發現，結石成分或細菌感染介導的炎癥-氧化應激反應會造成腎小管上皮細胞損傷，后者被認為是泌尿系結石形成的重要機制。Saeed等研究發現腎小管上皮細胞內吞草酸鈣晶體可激活溶酶體釋放大量活性酶和氧自由基，進而導致細胞損傷[12]。另有研究發現一水草酸鈣晶體會明顯抑制體外培養的腎小管上皮細胞的增殖；而且上皮細胞的凋亡率也會隨著晶體濃度的升高而增加[13]。腎小管上皮細胞損傷后形成的細胞碎片可為結石形成時的成核過程提供核心；腎小管上皮細胞的損傷破壞了腎小管正常的重吸收和分泌功能，從而可能導致尿液中成石物質的過飽和；當上皮細胞存在損傷時，成石物質在較低濃度時即可粘附形成結晶[14]。研究發現活性氧（ROS）及其產生的氧化應激也參與了結石的形成[12，15]：結石晶體誘導上皮細胞產生 ROS，氧化應激啟動P38 MAPK/JNK等信號通路，激活形成大量轉錄與生長因子，包括NFκB、TGFβ等，這些炎癥介質會造成上皮細胞過氧化損傷與死亡。暴露的基底膜則有利于結晶的黏附與停留，進而在集合管末端形成腎鈣斑 (Randall’splaques)；同時，ROS誘導的炎癥反應導致膠原蛋白沉積并形成纖維化。由此可見，炎癥反應及其形成的諸多蛋白產物是結石形成的重要成因。

當今主流觀點認為泌尿系結石的形成是環境、飲食、代謝、遺傳與感染等共同作用的結果。除了前文述及的結石促成因素之外，在人體內存在著較多的結石抑制物：大分子物質（核糖核酸、黏液素、酸性黏多糖、腎鈣素、蛋白多糖、骨橋蛋白（OPN）、非集合TH蛋白、間-α-胰蛋白酶抑制物等）和小分子物質（鎂、枸櫞酸鹽、α-亞麻酸、焦磷酸鹽等），均具有一定的抑制晶體形成的作用[16-18]。結石抑制物與結石促成物相互之間往往會由于機體功能異常而失衡，進而誘發結石形成。

本研究存在的局限性是隨機獲得的結石樣本例數少，而且結石樣本在儲存、研磨及蛋白提取過程中受到環境的影響，這也可能造成有效蛋白成分的丟失，這也直接影響了蛋白電泳結果與質譜分析結果。

總之，國內外眾多研究業已證實結石基質蛋白可通過多種機制參與泌尿系結石的形成。但是，不同結石成分的蛋白來源、是否有異同性、如何參與結石成核、生長、又是如何參與抑制結石形成的機制尚未闡明。泌尿系結石的形成機制觀點眾多，但可以肯定的是目前尚無任何一種機制能夠完全解釋結石的形成。泌尿系感染在結石的形成過程中肯定扮演重要的角色，但其具體的機制仍需要我們進一步研究及探討。

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