FOXM1在人類結(jié)腸癌中的表達及意義＊

曹原，堯陽揚，郭惠，劉鎮(zhèn)，熊建萍

(南昌大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006)

結(jié)腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴重威脅我國居民健康。在我國，隨著人群生活方式的日益西化以及過多高脂高熱食物的攝入、肥胖、吸煙以及缺乏鍛煉等因素，結(jié)直腸癌的發(fā)生率正在日益攀升，縱使目前手術(shù)技術(shù)及新輔助化療在結(jié)直腸癌早期診斷及治療上取得了一定的進步，但對結(jié)直腸癌伴遠處轉(zhuǎn)移的病人，其5年生存率仍在12.5%以下。結(jié)腸癌患者絕大多數(shù)初診時已為晚期，其病情進展快、預后差[1]。結(jié)腸癌的早期診斷技術(shù)落后是導致結(jié)腸癌死亡率及復發(fā)率高的主要原因，由于其確切的分子機制仍不甚清楚，目前缺乏有效的預防和治療措施。最近多項研究表明基因突變與結(jié)直腸癌的預后及治療密切相關(guān)，鑒于此，很多的分子靶向治療藥物應運而生[2-5]。因此，探討發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的新型腫瘤標志物和治療靶點，對于結(jié)腸癌的早期診斷、預后判斷和指導治療意義重大。

Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族成員轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白 M1（Forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）是叉頭盒蛋白家族重要的成員，是一種增殖相關(guān)的致瘤性的轉(zhuǎn)錄因子，具有在進化上保守的螺旋翼狀(Winged Helix)DNA結(jié)合域。FOXM1的表達僅局限于成人組織分裂活躍的細胞中，例如胸腺、睪丸、結(jié)腸和小腸，然而在靜止期或分化的細胞中幾乎不表達[6，7]。目前研究已證實FOXM1的表達對多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。大量基因芯片分析結(jié)果顯示FOXM1在超過20種實體腫瘤中高表達，如肝細胞癌、胰腺腺癌、乳癌、卵巢癌、肺癌以及結(jié)直腸癌等[8-14]。FOXM1在細胞增殖、凋亡、細胞周期進展、血管生成、EMT、DNA損傷修復和代謝等許多生理過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)已證實FOXM1可通過激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（PLAUR，urokinase-typeplasminogenactivator receptor）促進結(jié)腸癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移[14]。最近，一些研究已經(jīng)表明，F(xiàn)OXM1可增強DNA損傷修復基因，如乳腺癌相關(guān)基因（BRCA2），X線交叉互補基因 1（XRCC1）和 RAD5 的表達[16，17]，而敲除 FOXM1顯示降低了結(jié)腸癌細胞DNA復制[18]。

在本項研究中，我們用生物信息學網(wǎng)站GEPIA證實了絕大多數(shù)腫瘤中FOXM1的基因表達量都有不同程度的增加，同時查詢生物信息學網(wǎng)站cBioPortal發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中FOXM1的基因變異率較高，同時我們運用westren boltting技術(shù)比較結(jié)腸癌組織及其相對應的臨近非癌組織中FOXM1蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌組織中FOXM1的表達比鄰近非癌組織中的表達水平更高。這些結(jié)果表明，F(xiàn)OXM1在人類結(jié)腸癌中的表達量有所增加，并可能成為結(jié)腸癌患者的新型預后因子。

1　材料和方法

1.1臨床標本該研究方案經(jīng)南昌大學第一附屬醫(yī)院批準。在知情同意的情況下收集結(jié)腸癌患者的新鮮腸癌手術(shù)標本及對應的非癌組織共4對。

1.2蛋白質(zhì)印跡從新鮮組織中提取總蛋白，并用冰冷的裂解緩沖液裂解。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜，然后用針對FOXM1（Abgent，USA）和 β-肌動蛋白（Affinity，USA）的一級抗體進行免疫印跡，其次是辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（ZSGB，中國）。使用化學發(fā)光溶劑（Thermo，USA）檢測信號。

2　結(jié)果

2.1各腫瘤樣本及其配對正常組織的FOXM1的mRNA表達情況本研究中，我們使用生物信息學網(wǎng)站 GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）對 FOXM1在人類各惡性腫瘤樣本及其配對正常組織樣本中的mRNA表達情況進行分析。結(jié)果表明，在絕大多數(shù)樣品中FOXM1在腫瘤組織中的mRNA表達中值均大于其配對的正常組織樣品 （圖1A和1B）。其中在結(jié)腸癌樣品中的FOXM1的mRNA表達中值為30.78PTM，而在相應正常組織中的表達中值為2.47PTM。

圖1　圖1A GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有腫瘤樣品和配對的正常組織的FOXM1 mRNA表達譜。注：縱坐標代表腫瘤類型或正常組織中FOXM1的mRNA表達中值。圖1B GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）中跨所有腫瘤樣品和配對的正常組織的FOXM1 mRNA表達散點圖

2.2FOXM1在結(jié)直腸癌中DNA的改變情況為了進一步探討FOXM1基因在結(jié)腸癌中表達情況，對FOXM1在結(jié)直腸腺癌中的改變頻率及情況進行信息挖掘。一項研究統(tǒng)計了249例結(jié)腸腺癌患者FOXM1基因改變的情況，這些病例中有高達2.81%的病例出現(xiàn)FOXM1基因的改變，其中2.01%為突變，0.4%為擴增，0.4%為多重改變；還有一項統(tǒng)計數(shù)據(jù)針對122例直腸腺癌患者，這些病例中有高達2.46%的病例出現(xiàn)FOXM1基因的改變，其中1.64%為突變，0.82%為擴增；更有說服了的是，來自cBioPortal數(shù)據(jù)庫的一項更大樣本量的統(tǒng)計同時納入了結(jié)腸腺癌和直腸腺癌患者，發(fā)現(xiàn)在2001例結(jié)直腸癌病例中有0.8%的病例出現(xiàn)FOXM1基因的改變，其中0.75%為突變，0.05%為擴增（見圖2A）。說明FOXM1在結(jié)直腸癌，尤其是結(jié)腸癌中的存在高頻率的DNA突變現(xiàn)象。

2.3結(jié)腸癌組織中FOXM1蛋白的表達較臨近非癌組織高在查詢和挖掘上訴生物信息學依據(jù)之后，我們通過westren blotting技術(shù)對4對結(jié)腸癌及其鄰近非癌組織進行FOXM1蛋白質(zhì)表達分析，以驗證結(jié)腸癌中FOXM1在蛋白水平的表達。結(jié)果顯示：4對組織中，結(jié)腸癌組織中FOXM1蛋白的表達比鄰近非癌組織中的表達水平更高（圖3A）。

圖2　圖2A cBioPortal(http：//www.cbioportal.org)中3項數(shù)據(jù)顯示FOXM1在結(jié)直腸癌中的DNA的改變情況。

圖3　圖3A 6對結(jié)腸癌及其鄰近非癌組織的FOXM1表達水平

3　討論

Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXM1是一種進化上保守的致癌性轉(zhuǎn)錄因子。FOXM1在細胞增殖、凋亡、細胞周期進展、血管生成、EMT、DNA損傷修復和代謝等許多生理過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，F(xiàn)OXM1表達與晚期非小細胞肺癌患者的預后不良相關(guān)，并且與非小細胞肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[19，20，21]。 在白血病細胞中，miR-370的異位表達通過靶向抑制FOXM1表達，誘導細胞生長停滯和衰老[22]。現(xiàn)已證實FOXM1可通過激活尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（PLAUR，urokinasetype plasminogen activator receptor）促進結(jié)腸癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。FOXM1還可增強DNA損傷修復基因，如乳腺癌相關(guān)基因（BRCA2），X線交叉互補基因 1 （XRCC1） 和 RAD51的表達[16，17]。 此外，Yoshida等[18]發(fā)現(xiàn)FOXM1基因敲除小鼠結(jié)腸癌細胞DNA復制及生長能力顯著減弱。一項研究表明，F(xiàn)OXM1靶向Nijmegen破壞綜合征1（NBS1）來調(diào)節(jié)DNA損傷誘導的乳腺癌細胞衰老[22]。miRNA在結(jié)腸癌中的研究也越來越多[23]，既往的文獻表明多種miRNA可以靶向FOXM1參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞的耐藥[22，24]。

在本項研究中，我們通過在生物信息學網(wǎng)站，挖掘了人類各腫瘤樣本中FOXM1的表達情況，發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)人類腫瘤樣本中FOXM1的表達中值均大于正常組織，這表明，F(xiàn)OXM1的異常表達在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。FOXM1在結(jié)直腸癌中基因突變和擴增比較頻繁，基因水平的異常改變是FOXM1表達異常的重要原因之一。通過大數(shù)據(jù)我們證實了FOXM1在結(jié)腸癌中的DNA改變頻率較高，mRNA的表達較正常組織高，并且我們結(jié)合實驗證實腫瘤中FOXM1在蛋白水平上表達較正常組織亦增高。因此我們認為FOXM1作為結(jié)腸癌患者新的治療靶點及預后生物指標是有意義的。

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