BDE-28及BDE-99對斑馬魚早期生命階段HPT、HPG和HPA軸功能基因表達(dá)水平的影響

靳亞茹，劉紅玲,* ，韓志華，花小雪

1. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京 210023 2. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

多溴聯(lián)苯醚(poly brominated diphenyl ethers, PBDEs)作為一種曾被廣泛應(yīng)用的溴代阻燃劑[1]，已被禁止生產(chǎn)和使用近10年[2]，但仍能在許多環(huán)境介質(zhì)包括空氣[3]、水體[4]、土壤[5]、灰塵、底泥[6]和各種生物體[7-10]甚至人體母乳、血液、頭發(fā)、胎盤以及嬰兒血液[11-15]中檢出它們的存在。其中2,4,4'-三溴聯(lián)苯醚(2,4,4'-tribromodiphenyl ether, BDE-28)和2,2',4,4',5-五溴聯(lián)苯醚(2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether, BDE-99)是在長江下游底泥中檢出濃度最高的PBDE類物質(zhì)，甚至超過了2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether, BDE-47)[16]。另外，在長江的水生生物如蝦類、蟹類、雜食性魚類、植食性魚類和肉食性魚類中也都有檢出BDE-28和BDE-99，其中BDE-28的檢出比例尤其高(10.9%)，超過了國外一般檢出水平[17]。因此BDE-28和BDE-99是否會對水生生物中造成負(fù)效應(yīng)引起了我們的關(guān)注。

動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，研究較多的BDE-47會導(dǎo)致鳥類、魚類和哺乳動物的神經(jīng)發(fā)育毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌紊亂[18-23]，而且較低溴代的BDE-28和更高溴代的BDE-99也會對部分生物甚至人體健康產(chǎn)生不良影響。例如，已有毒性研究發(fā)現(xiàn)BDE-28影響斑馬魚幼魚的生長發(fā)育且對小孩的神經(jīng)發(fā)育有不良影響[24-25]，而且BDE-99也會對紅耳龜(red-eared sliders)、大鼠和鳥類的生長發(fā)育、神經(jīng)行為以及生殖行為有負(fù)面效應(yīng)[20,26-30]。由于PBDE類物質(zhì)與甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)的結(jié)構(gòu)相似，所以它們被認(rèn)為是潛在的甲狀腺內(nèi)分泌干擾物。研究較多的BDE-47被報道作用于大鼠甲狀腺受體，改變?nèi)梭w中T3和T4濃度并對斑馬魚下丘腦-垂體-甲狀腺(hypothalamus-pituitary-thyroidal, HPT)軸基因表達(dá)有影響[31-33]。另外，也有文獻(xiàn)表明人體內(nèi)TH濃度與體內(nèi)BDE-28和BDE-99濃度相關(guān)[34]。而且有研究表明BDE-99暴露能改變青年大鱗大麻哈魚(Chinook salmon)和大鼠體內(nèi)甲狀腺激素水平，并影響大鼠小腦顆粒神經(jīng)元中甲狀腺激素受體基因的表達(dá)[35-37]。

綜上所述，BDE-28和BDE-99與其具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)BDE-47一樣對生物體和人類有潛在的神經(jīng)發(fā)育、生殖和甲狀腺相關(guān)的內(nèi)分泌干擾作用。然而，關(guān)于BDE-28和BDE-99對水生生物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和機(jī)制研究還較少。同時，有學(xué)者提出影響甲狀腺系統(tǒng)的PBDE同系物也能影響硬骨魚的生殖系統(tǒng)[38]。例如，BDE-47喂食暴露會損害黑頭呆魚(fathead minnow)的甲狀腺功能并影響其生殖發(fā)育[39]。類似地，DE-71攝入會同時影響斑馬魚的甲狀腺激素濃度和產(chǎn)卵率[40]。Yu等[41-42]報道，在胚胎到成魚階段暴露于低濃度的DE-71不僅改變了HPT軸和TH相關(guān)基因的表達(dá)，而且改變了下丘腦-垂體-性腺(hypothalamus-pituitary-gonadal, HPG)軸和性激素相關(guān)基因的表達(dá)，并減少了斑馬魚的產(chǎn)卵量。在中國稀有鮈鯽(Chinese rare minnow)中，十溴聯(lián)苯醚(decabromodiphenyl ether, BDE-209)暴露可能導(dǎo)致成魚TH相關(guān)基因表達(dá)的改變并對雄性睪丸中精子發(fā)生產(chǎn)生抑制[43]。另外，有研究表明在斑馬魚中已經(jīng)觀察到下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA)和HPG軸之間的交互作用，表明化學(xué)物質(zhì)可以通過降低E2的濃度從而使HPA軸基因的表達(dá)下調(diào)并降低皮質(zhì)醇的濃度[44]。并且在非哺乳類脊椎動物實驗中也發(fā)現(xiàn)HPA軸及HPG軸之間存在交互作用[45]。除此之外也有實驗證明，化合物對斑馬魚體內(nèi)某一內(nèi)分泌軸的影響也將間接影響斑馬魚的其他內(nèi)分泌軸[44, 46]。在脊椎動物中，生殖、甲狀腺和腎上腺內(nèi)分泌系統(tǒng)主要由HPT、HPA和HPG軸控制，這3個系統(tǒng)通路通過協(xié)調(diào)激素的合成、分泌、運輸和代謝來調(diào)節(jié)其動力學(xué)過程[32,44,47]。所以本文選擇與人體基因有87%相似的斑馬魚為模式生物，展開BDE-28和BDE-99對斑馬魚HPT、HPG和HPA內(nèi)分泌軸上相關(guān)基因影響研究，從而探究它們的內(nèi)分泌干擾機(jī)制。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　實驗材料

BDE-28、BDE-99(純度>99.2%)，購自美國AccuStandard公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，分析純，購自南京化學(xué)試劑有限公司，作助溶劑；RNA抽提試劑盒(RNeasy?Mini Kit)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Omniscript RT Kit)均購自德國Qiagen公司；實時定量PCR試劑盒(SYBR?Real time PCR Master Mix Plus Kits)購自日本東洋紡公司。

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(ZKH-BM09)購自中國青島中科海水處理有限公司；多功能連續(xù)變倍體視顯微鏡(AZ100)購自日本尼康公司；智能光照培養(yǎng)箱購自寧波海曙賽福實驗儀器廠；分析天平(AUY120)購自日本島津公司；魚孵化器(WT-2005)購自旺通五金電器廠；全功能酶標(biāo)儀(Synergy H4)購自美國Biotek公司；q-RT-PCR儀(Applied Biosystems Stepone Plus Real-time PCR System)購自美國Applied biosystems公司。

1.2　斑馬魚馴化及胚胎收集

5月齡野生AB型成年斑馬魚是由本實驗室在斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(ZKH-BM09)自行繁殖并養(yǎng)殖成熟。該半自動斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)配備曝氣充氧泵、紫外殺菌燈、系統(tǒng)過濾器、溫度控制系統(tǒng)、光周期控制系統(tǒng)并可維持系統(tǒng)的水持續(xù)循環(huán)。系統(tǒng)運行期間，維持溫度在27 ℃～29 ℃的自來水供斑馬魚生存，并維持系統(tǒng)光暗比14 h:10 h，每天喂食3次新鮮孵化的豐年蟲。

光照刺激對斑馬魚產(chǎn)卵非常重要，一般產(chǎn)卵發(fā)生在清晨開燈后30 min以內(nèi)。由于斑馬魚會自食其卵，因此我們選擇底部帶有小孔塑料板的孵化器來進(jìn)行斑馬魚產(chǎn)卵。前1天晚將3條雌魚和3條雄魚放進(jìn)一個底部帶有孔塑料板的孵化器，并用孵化器自帶的塑料隔板將雌魚與雄魚分開。第2天清晨開燈時，將孵化器中間的塑料隔板撤去，讓雄魚與雌魚在光刺激下交配產(chǎn)卵。30 min后將魚卵取出并置于培養(yǎng)皿中，使用統(tǒng)一配制充氧飽和的60 mg·L-1海鹽水清洗胚胎后，置于體視顯微鏡下觀察。剔除未發(fā)生卵裂以及卵裂不正常的胚胎，這些不正常的胚胎主要表現(xiàn)為初期無卵裂或卵裂細(xì)胞大小不均等。然后將斑馬魚胚胎培養(yǎng)于(28 ± 1) ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中。在斑馬魚胚胎受精后4 h(4 hours post fertilization, 4 hpf)統(tǒng)一進(jìn)行暴露實驗。

1.3　斑馬魚胚胎暴露實驗

使用前將BDE-28和BDE-99分別配成高濃度的DMSO母液，實驗中所用相應(yīng)濃度的暴露液由高濃度母液經(jīng)胚胎培養(yǎng)水稀釋而得，并且保證最高濃度暴露液中DMSO不超過暴露溶液體積的0.1%。暴露液現(xiàn)用現(xiàn)配，設(shè)置BDE-28和BDE-99水暴露溶液的濃度為2 μg·L-1、20 μg·L-1和200 μg·L-1，對照為0.1%的DMSO溶液。使用25 mL燒杯作為本次實驗的暴露容器，實驗設(shè)置3次生物學(xué)平行，每個燒杯中加入20 mL的暴露液，20枚發(fā)育正常的胚胎，放置于光照培養(yǎng)箱中。另外，為了防止溶液蒸發(fā)，覆蓋保鮮膜于暴露容器上，有實驗表明覆蓋保鮮膜不會影響斑馬魚胚胎/幼魚的正常生長和發(fā)育[32]。暴露期間及時將停止發(fā)育或死亡的胚胎和幼魚用一次性吸管吸出，以免影響其他胚胎/幼魚的生長。在胚胎受精后120 h(120 hpf)，將各濃度對應(yīng)的斑馬魚幼魚收取到1.5 mL無RNA酶的離心管中，盡量將水分吸干，加入RNAlater試劑對樣品進(jìn)行固定(確保幼魚樣品浸沒在RNAlater溶液中)，置于-80 ℃超低溫冰箱中待后續(xù)實驗。

1.4　斑馬魚幼魚總RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄和q-RT-PCR實驗

本研究使用q-RT-PCR技術(shù)對HPT、HPG及HPA軸相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行檢驗，因此首先需要對所取得的樣品進(jìn)行總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄。各濃度組孵化出的斑馬魚樣品使用RNA抽提試劑盒進(jìn)行總RNA提取。RNA抽提結(jié)束，使用酶標(biāo)儀TAKE 3軟件測定總RNA的量和OD260/OD280的比值，比值顯示1.9～2.1之間說明純度較好。根據(jù)測得的RNA濃度，使用無RNA酶的水將所有樣品稀釋到相同的濃度后，盡快使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RNA抽提與逆轉(zhuǎn)錄過程嚴(yán)格按照試劑盒所述方法。最后使用SYBR實時定量PCR試劑盒對逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增和測定。所選擇的基因以及引物序列如之前文獻(xiàn)中所描述[48]。

該實驗RT-PCR條件設(shè)置如下：初始變性時間10 min，擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增條件為首先升溫至95 ℃維持15 s，然后降至60 ℃保持1 min。目標(biāo)片段擴(kuò)增后，畫出溶解曲線確保所有cDNA樣品均僅能擴(kuò)增出唯一目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1　斑馬魚胚胎暴露于2、20或200 μg·L-1的BDE-28至120 hpf時(A)下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)、(B)下丘腦-垂體-性腺(HPG)和(C)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的基因表達(dá)變化注：結(jié)果表示為3次重復(fù)的平均值±SD，*P <0.05和**P <0.01表明暴露組與對照組相比有顯著性差異。Fig. 1　Expression of genes along the (A) HPT axis, (B) HPG axis, and (C) HPA axis of zebrafish embryo at 120 hpf following 2, 20 or 200 μg·L-1 BDE-28 exposureNote: Results were expressed as means±SD of three replicates. * P<0.05 and ** P<0.01 indicate significant differences in exposure groups compared with control group.

圖2　暴露于2、20和200 μg·L-1的BDE-28后，斑馬魚幼魚的3個軸((A)HPT軸、(B)HPG軸和(C)HPA軸)在各濃度下的效應(yīng)結(jié)果和可能的毒性途徑Fig. 2　Concentration dependent effects and proposed toxicity pathways along the three axes ((A) HPT axis, (B) HPG axis and (C) HPA axis) of zebrafish larvae exposed to 2, 20 and 200 μg·L-1 BDE-28

1.5　數(shù)據(jù)處理

使用LinRegPCR處理q-RT-PCR的原始數(shù)據(jù)，然后以持家基因18S rRNA作為mRNA表達(dá)內(nèi)參，用空白對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過2-ΔΔCt方法計算基因的調(diào)控倍數(shù)[49]。基因調(diào)控數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 5(GraphPad，San Diego，CA，USA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。在GraphPad中使用單因素方差分析(ANOVA)并隨后通過多重比較Tukey檢驗方法分析暴露組與對照組基因調(diào)控倍數(shù)之間的顯著性差異，當(dāng)P< 0.05時即表示存在顯著性差異。

2　結(jié)果 (Results)

本研究使用q-RT-PCR技術(shù)研究了BDE-28和BDE-99對斑馬魚胚胎/幼魚HPT、HPG和HPA軸上相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。結(jié)果表明斑馬魚胚胎暴露于BDE-28和BDE-99在不同程度上引起3個內(nèi)分泌軸上相關(guān)基因的表達(dá)變化，總的來說，BDE-28主要引起相關(guān)基因發(fā)生顯著性下調(diào)而BDE-99引起相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生顯著性上調(diào)。

圖1和圖2展示了BDE-28暴露后HPT、HPG和HPA軸相關(guān)基因的表達(dá)情況。從圖1(A)和圖2(A)可以看出，與下丘腦相關(guān)的促甲狀腺激素釋放激素基因(trh)表達(dá)在2、20和200 μg·L-1分別顯著下調(diào)3.53、3.89和2.43倍。與HPT軸相關(guān)的垂體基因的表達(dá)在BDE-28作用下都有下調(diào)趨勢。促甲狀腺激素β基因(tshb)和促甲狀腺激素釋放激素受體2基因(trhr2)在暴露于2 μg·L-1的BDE-28之后分別顯著下調(diào)2.17和2.44倍，而在暴露于200 μg·L-1的BDE-28之后分別顯著下調(diào)2.99和2.70倍。甲狀腺激素受體α和β(trα and trβ)在3個暴露濃度下都發(fā)生了顯著下調(diào)，在由低到高暴露濃度下trα和trβ分別下調(diào)2.20、2.16、2.31倍和3.64、2.30和2.42倍。同時，在3個暴露濃度下促甲狀腺激素受體基因(tshr)分別顯著下調(diào)了4.14、3.00和3.93倍。暴露于2和20 μg·L-1的BDE-28后，Na+/I同向載體(nis)的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)了2.79倍和2.54倍，而甲狀腺球蛋白(tg)顯著下調(diào)了2.53倍和2.32倍。脫碘酶1(dio1)在2 μg·L-1的BDE-28暴露下顯著上調(diào)5.04倍。

BDE-28還對HPG軸相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響，具體如圖1(B)和圖2(B)。下丘腦相關(guān)基因促性腺激素釋放激素基因2和3(gnrh2和gnrh3)在2、20和200 μg·L-1的BDE-28暴露后分別顯著下調(diào)4.59、3.22、2.34倍和2.43、2.18、2.60倍。垂體中相關(guān)基因基本都呈下調(diào)趨勢，其中促性腺激素釋放激素類似物1和4(gnrhr1和gnrhr4)在2、20和200 μg·L-1分別下調(diào)2.79、2.19、2.92倍和3.23、2.35、2.65倍，而gnrhr2只有在最低暴露濃度顯著下調(diào)2.10倍。斑馬魚幼魚體內(nèi)雌激素受體基因a(era)在最高暴露濃度下顯著下調(diào)2.84倍，而雄激素受體(ar)在低和中暴露濃度下分別下調(diào)2.44和2.26倍。BDE-28也使性腺中相關(guān)基因表現(xiàn)出不同程度地變化，如促濾泡激素受體(fshr)和雌激素合成的細(xì)胞色素P450(cyp17)在2、200 μg·L-1的暴露濃度下分別顯著下調(diào)2.65、4.18倍和2.90、4.38倍，而芳香化酶a(cyp19a)在高濃度暴露下顯著下調(diào)4.07倍。3β-羥類固醇脫氫酶(3βhsd)在中濃度下顯著下調(diào)2.08倍，而在高濃度下顯著下調(diào)4.75倍。羥甲基戊二酰輔酶a還原酶(hmgra)和類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白基因(star)在低、中暴露濃度下分別顯著下調(diào)3.41、2.59倍和4.08、2.65倍。

此外，BDE-28還影響HPA軸相關(guān)基因的表達(dá)(如圖1(C)和圖2(C))。在2 μg·L-1的BDE-28作用下下丘腦中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(crh)和垂體中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白(crhbp)分別顯著上調(diào)5.80倍和4.53倍。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2(crhr2)在低、中濃度下分別下調(diào)2.52和2.09倍。另外，垂體中阿片黑素促皮質(zhì)素原(pomc)在中、高濃度下分別顯著下調(diào)3.08和3.54倍。鹽皮質(zhì)激素受體(mr)和糖皮質(zhì)激素受體(gr)在低、中、高暴露濃度下分別顯著下調(diào)4.04、2.33、2.69倍和3.69、2.30、2.34倍。在腎上腺中，hmgra、hmgrb、3βhsd、star、cyp17和cyp19a表達(dá)情況跟上述HPG軸中一樣，其余基因都沒有顯著性變化。

BDE-99與BDE-28的作用方式不同，BDE-99暴露后HPT、HPG和HPA軸相關(guān)的基因大部分呈下調(diào)狀態(tài)(如圖2)，且大多基因效應(yīng)強(qiáng)度與BDE-99濃度成反比，在較低濃度下具有較大的倍數(shù)變化。在HPT軸中(如圖3(A)和圖4(A))，下丘腦相關(guān)的基因trh在2 μg·L-1的BDE-99暴露下顯著上調(diào)2.77倍，而在20或200 μg·L-1下沒有顯著變化。在垂體中，trhr2和tra在最低暴露濃度下分別顯著上調(diào)4.20和3.91倍，其他基因與空白組相比沒有顯著性變化。在甲狀腺中，nis、tshr、tg和dio1在最低暴露濃度下分別上調(diào)5.35、3.43、3.74和5.04倍。

BDE-99暴露后，HPG軸上基因也發(fā)生了變化(如圖3(B)和圖4(B))。下丘腦相關(guān)基因gnrh2和gnrh3在2 μg·L-1的BDE-99暴露下分別下調(diào)了3.00倍和4.83倍，而在較高濃度下沒有顯著變化。同樣地，垂體相關(guān)基因gnrhr1、gnrhr2、erb、ar和fshb也在最低暴露濃度下分別顯著上調(diào)2.50、3.46、2.18、2.78和3.93倍，而在其他濃度沒有顯著變化。性腺相關(guān)的基因cyp19a、lhr、hmgra、hmgrb、3βhsd3和cyp17在最低暴露濃度下分別顯著上調(diào)3.81、4.06、2.69、4.02、4.04和3.01倍，其中3βhsd3 和cyp17在最高濃度下顯著下調(diào)2.44和2.29倍。

圖3　斑馬魚胚胎暴露于2、20或200 μg·L-1的BDE-99至120 hpf時(A)下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)、(B)下丘腦-垂體-性腺(HPG)和(C)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的基因表達(dá)變化注：結(jié)果表示為3次重復(fù)的平均值±SD，* P <0.05和** P <0.01表明暴露組與對照組相比有顯著性差異。Fig. 3　Expression of genes along the (A) HPT axis, (B) HPG axis, and (C) HPA axis of zebrafish embryo at 120 hpf following 2, 20 or 200 μg·L-1 BDE-99 exposureNote: Results were expressed as means±SD of three replicates. * P<0.05 and ** P<0.01 indicate significant differences in exposure groups compared with control group.

圖4　暴露于2、20和200 μg·L-1的BDE-99后，斑馬魚幼魚的3個軸((A)HPT軸、(B)HPG軸和(C)HPA軸)在各濃度下的效應(yīng)結(jié)果和可能的毒性途徑Fig. 4　Concentration dependent effects and proposed toxicity pathways along the three axes ((A) HPT axis, (B) HPG axis and (C) HPA axis) of zebrafish larvae exposed to 2, 20 and 200 μg·L-1 BDE-99

除此之外，BDE-99也對HPA軸相關(guān)的基因產(chǎn)生了影響(如圖3(C)和圖4(C))。與下丘腦相關(guān)基因crh只在最低暴露濃度下顯著上調(diào)3.80倍，并且與垂體相關(guān)基因pomc、crhbp、crhr2和gr也只在最低暴露濃度下顯著上調(diào)2.46、2.53、3.87和3.87倍，而下丘腦和垂體中其他基因在任何暴露濃度下都沒有顯著變化。與腎上腺相關(guān)基因mc2r、hmgra、hmgrb和cyp19a在2 μg·L-1的BDE-99暴露下分別顯著上調(diào)4.40、2.69、4.02和3.81倍，而在其他暴露濃度無顯著變化。3βhsd和cyp17在2 μg·L-1的BDE-99暴露下分別顯著上調(diào)4.04和3.01倍，而在200 μg·L-1時分別顯著下調(diào)2.44和2.29倍。

圖5　BDE-28和BDE-99暴露后(A)HPT軸(B)HPG軸及(C)HPA軸相關(guān)基因表達(dá)情況的主成分分析注：每個點都代表相應(yīng)物質(zhì)暴露后基因的表達(dá)情況，而橢圓區(qū)域代表95%的置信區(qū)間。Fig. 5　Principal component analysis (PCA) of genes expression associated with (A) HPT (B) HPG (C) HPA axes after BDE-28/BDE-99 exposureNote: Each point represents the genes expression after exposure to the corresponding substance and the elliptical area represents the 95% confidence interval.

3　討論 (Discussion)

本文研究了BDE-28和BDE-99對斑馬魚體內(nèi)HPT軸的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDE-28暴露后與甲狀腺激素合成通路相關(guān)的基因nis、tg、tshr、tra和trb顯著下調(diào)，這可能會使斑馬魚體內(nèi)TH的合成量改變。脫碘酶1(dio1)顯著上調(diào)導(dǎo)致T4更多地轉(zhuǎn)化為有活性的T3，從而可能導(dǎo)致體內(nèi)有活性的甲狀腺激素水平失衡。這一結(jié)果與之前相關(guān)研究一致，之前研究表明人體妊娠期間體內(nèi)BDE-28的存在與T4和T3濃度變化有關(guān)[34]。trh涉及下丘腦向垂體的信號傳遞過程，所以trh下調(diào)也導(dǎo)致垂體中相關(guān)基因trhr2和tshb顯著下調(diào)，這些基因的調(diào)控變化也會最終影響TH的合成。BDE-99暴露使斑馬魚體內(nèi)甲狀腺合成通路相關(guān)的基因nis、tg、tshr、dio1、tra和trb顯著上調(diào)，從而有可能使斑馬魚體內(nèi)TH濃度升高。而下丘腦和垂體中相關(guān)基因trh與trhr2的上調(diào)傳遞給甲狀腺相應(yīng)的上調(diào)信號，從而也導(dǎo)致TH合成增加。之前有研究也表明人體內(nèi)BDE-99含量與T3含量成正比關(guān)系[50]。但是，最近有研究報道BDE-99暴露降低青年大鱗大麻哈魚和大鼠體內(nèi)T3、T4濃度[35, 37]。本研究中BDE-99對斑馬魚HPT軸的作用與大鱗大麻哈魚和大鼠相關(guān)研究結(jié)果的不一致可能是由生物種類差異導(dǎo)致的。

已有大量研究表明HPG軸與HPT軸有交互作用[38,44]，所以BDE-28和BDE-99也可能直接或間接地作用于HPG。因此，本研究展開了2種物質(zhì)對HPG軸基因表達(dá)影響的研究，結(jié)果顯示暴露于BDE-28和BDE-99影響了HPG軸上的基因表達(dá)，從而可能影響了斑馬魚體內(nèi)11KT和E2的合成。在暴露于BDE-28之后，下丘腦和垂體中基因gnrh2、gnrh3、gnrhr1、gnrhr2和gnrhr4顯著下調(diào)，這可能導(dǎo)致性腺激素合成發(fā)生改變。且與性腺激素合成過程相關(guān)的基因fshr、hmgra、star、3βhsd、cyp17、cyp19a、era和ar都顯著下調(diào)，這可能導(dǎo)致性腺激素合成減少。關(guān)于BDE-99的研究結(jié)果表明，在2 μg·L-1的BDE-99暴露后，lhr、hmgra、hmgrb、3βhsd、cyp17、cyp19a、erb和ar都顯著上調(diào)，這可能導(dǎo)致E2和11KT合成和釋放增加。而且另一項研究也表明BDE-99能刺激雄激素生成[51]。另外，之前關(guān)于斑馬魚的研究表明PBDE不僅改變了HPT軸和TH濃度中的基因的表達(dá)，而且改變了HPG軸基因的表達(dá)和性激素濃度并降低了成年魚的產(chǎn)卵量[41-42]。本研究中BDE-28和BDE-99的研究結(jié)果也驗證了這一結(jié)果，它們不僅影響斑馬魚HPT軸基因的表達(dá)，而且也可能直接或間接地影響HPG軸基因表達(dá)從而可能導(dǎo)致魚類繁殖性能的破壞。

到目前為止，關(guān)于PBDE對HPA軸的影響基本上尚未被研究。而從本研究結(jié)果可以看出斑馬魚經(jīng)過BDE-28和BDE-99暴露后，腎上腺中相關(guān)基因cyp17、3βhsd、cyp19a、hmgra、hmgrb以及mr和gr都有顯著變化，這說明這2種物質(zhì)可能導(dǎo)致腎上腺激素合成發(fā)生改變。有研究表明化學(xué)物質(zhì)可以通過降低斑馬魚體內(nèi)E2的濃度從而使HPA軸基因的表達(dá)下調(diào)并降低皮質(zhì)激素的濃度[44]。所以本研究結(jié)果表明，BDE-28和BDE-99也可能通過HPG軸間接地作用于HPA軸。另外，已有學(xué)者證明在非哺乳類脊椎動物中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)(激活HPA軸的主要神經(jīng)激素)也是促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)的刺激因子[45]。在魚類中，CRH比促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin releasing hormone, TRH)更能有效地刺激TSH的釋放[45]。所以本研究中BDE-28和BDE-99對HPT軸的影響也可能是由于其對HPA軸的作用間接導(dǎo)致的。

通過BDE-28與BDE-99暴露后3個內(nèi)分泌軸的基因表達(dá)情況的主成分分析(principal component analysis, PCA)發(fā)現(xiàn)，BDE-28和BDE-99暴露后，斑馬魚HPT(如圖5(A))、HPG(如圖5(B))和HPA(如圖5(C))軸相關(guān)基因表達(dá)情況的橢圓區(qū)域都沒有重疊部分。這一結(jié)果表明BDE-28和BDE-99可能通過不同的毒性通路影響斑馬魚的HPT、HPG和HPA軸。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]Talsness C E. Overview of toxicological aspects of polybrominated diphenyl ethers: A flame-retardant additive in several consumer products [J]. Environmental Research, 2008, 108(2): 158-167

[2]Ross P S, Couillard C M, Ikonomou M G, et al. Large and growing environmental reservoirs of deca-BDE present an emerging health risk for fish and marine mammals [J]. Marine Pollution Bulletin, 2009, 58(1): 7-10

[3]Bo S, Dodder N G, Ilora Basu A, et al. Concentrations and spatial variations of polybrominated diphenyl ethers and other organohalogen compounds in Great Lakes air [J]. Environmental Science & Technology, 2001, 35(6): 1078-1083

[4]Oros D R, Hoover D, Rodigari F, et al. Levels and distribution of polybrominated diphenyl ethers in water, surface sediments, and bivalves from the San Francisco Estuary [J]. Environmental Science & Technology, 2005, 39(1): 33-41

[5]Wu M H, Pei J C, Zheng M, et al. Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in soil and outdoor dust from a multi-functional area of Shanghai: Levels, compositional profiles and interrelationships [J]. Chemosphere, 2015, 118(1): 87-95

[6]Wang J, Lin Z, Lin K, et al. Polybrominated diphenyl ethers in water, sediment, soil, and biological samples from different industrial areas in Zhejiang, China [J]. Journal of Hazardous Materials, 2011, 197(6): 211-219

[7]Luross J M, Alaee M, Sergeant D B, et al. Spatial distribution of polybrominated diphenyl ethers and polybrominated biphenyls in lake trout from the Laurentian Great Lakes [J]. Chemosphere, 2002, 46(5): 665-672

[8]Su G Y, Gao Z S, Yu Y, et al. Polybrominated diphenyl ethers and their methoxylated metabolites in anchovy (Coilia, sp.) from the Yangtze River Delta, China [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2010, 17(3): 634-642

[9]Su G, Xia J, Liu H, et al. Dioxin-like potency of HO- and MeO- analogues of PBDEs’ the potential risk through consumption of fish from Eastern China [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(19): 10781-10788

[10]Hu G C, Dai J Y, Xu Z C, et al. Bioaccumulation behavior of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in the freshwater food chain of Baiyangdian Lake, North China [J]. Environment International, 2010, 36(4): 309-315

[11]de Wit C A. An overview of brominated flame retardants in the environment [J]. Chemosphere, 2002, 46(5): 583-624

[12]Hites R A. Polybrominated diphenyl ethers in the environment and in people: A meta-analysis of concentrations [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(4): 945-956

[13]Norén K, Meironyté D. Certain organochlorine and organobromine contaminants in Swedish human milk in perspective of past 20-30 years [J]. Chemosphere, 2000, 40(9-11): 1111-1123

[14]Leonetti C, Butt C M, Hoffman K, et al. Concentrations of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and 2,4,6-tribromophenol in human placental tissues [J]. Environment International, 2016, 88: 23-29

[15]Zheng J, Chen K H, Luo X J, et al. Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in paired human hair and serum from e-waste recycling workers: Source apportionment of hair PBDEs and relationship between hair and serum [J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(1): 791-796

[16]Shen M, Yu Y, Zheng G J, et al. Polychlorinated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers in surface sediments from the Yangtze River Delta [J]. Marine Pollution Bulletin, 2006, 52(10): 1299-1304

[17]Gao Z S, Jie X, Xian Q M, et al. Polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) in aquatic biota from the lower reach of the Yangtze River, East China [J]. Chemosphere, 2009, 75(9): 1273-1279

[18]Thornton L M, Path E M, Nystrom G S, et al. Early life stage exposure to BDE-47 causes adverse effects on reproductive success and sexual differentiation in fathead minnows (Pimephales promelas) [J]. Environmental Science & Technology, 2016, 50(14): 7834-7841

[19]Currier H A, Letcher R J, Williams T D, et al. Effects of the bioaccumulative polybrominated diphenyl ether flame retardant congener BDE-47 on growth, development, and reproductive success in zebra finches [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2015, 94(2):140-145

[20]Eisenreich K M, Rowe C L. Dietary exposure of BDE-47 and BDE-99 and effects on behavior, bioenergetics, and thyroid function in juvenile red-eared sliders (Trachemys scripta elegans) and common snapping turtles (Chelydra serpentina) [J]. Environmental Toxicology & Chemistry, 2014, 33(12): 2810-2817

[21]Liu H, Tang S, Zheng X, et al. Bioaccumulation, biotransformation, and toxicity of BDE-47, 6-OH-BDE-47, and 6-MeO-BDE-47 in early life-stages of zebrafish (Danio rerio) [J]. Environmental Science & Technology, 2016, 49(3): 1823-1833

[22]Muirhead E K, Skillman A D, Hook S E, et al. Oral exposure of PBDE-47 in fish: Toxicokinetics and reproductive effects in Japanese medaka (Oryzias latipes) and fathead minnows (Pimephales promelas) [J]. Environmental Science & Technology, 2006, 40(2): 523-528

[23]Zhao J, Xu T, Yin D Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes [J]. Chemosphere, 2014, 94: 53-61

[24]Adgent M A, Hoffman K, Goldman B D, et al. Brominated flame retardants in breast milk and behavioral and cognitive development at 36 months [J]. Paediatric & Perinatal Epidemiology, 2014, 28(1): 48-57

[25]Shy C G, Huang H L, Changchien G P, et al. Neurodevelopment of infants with prenatal exposure to polybrominated diphenyl ethers [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2011, 87(6): 643-648

[26]Zhao W, Cheng J, Gu J, et al. Assessment of neurotoxic effects and brain region distribution in rat offspring prenatally co-exposed to low doses of BDE-99 and methylmercury [J]. Chemosphere, 2014, 112: 170-176

[27]Cheng J, Gu J, Ma J, et al. Neurobehavioural effects, redox responses and tissue distribution in rat offspring developmental exposure to BDE-99 [J]. Chemosphere, 2009, 75(7): 963-968

[28]Eng M L, Elliott J E, Macdougallshackleton S A, et al. Early exposure to 2,2′,4,4′,5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches [J]. Toxicological Sciences, 2012, 127(1): 269-276

[29]Eng M L, Elliott J E, Williams T D. An assessment of the developmental toxicity of BDE-99 in the European starling using an integrated laboratory and field approach [J]. Ecotoxicology, 2014, 23(8): 1505-1516

[30]Viberg H, Fredriksson A, Eriksson P. Deranged spontaneous behaviour and decrease in cholinergic muscarinic receptors in hippocampus in the adult rat, after neonatal exposure to the brominated flame-retardant, 2,2′,4,4′,5-pentabromodiphenyl ether (PBDE 99) [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2005, 20(2): 283-288

[31]Chan W K, Chan K M. Disruption of the hypothalamic-pituitary-thyroid axis in zebrafish embryo-larvae following waterborne exposure to BDE-47, TBBPA and BPA [J]. Aquatic Toxicology, 2012, 108(1): 106-111

[32]Zheng X, Zhu Y, Liu C, et al. Accumulation and biotransformation of BDE-47 by zebrafish larvae and teratogenicity and expression of genes along the hypothalamus-pituitary-thyroid axis [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(23): 12943-12951

[33]Suvorov A, Bissonnette C, Takser L, et al. Does 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether interact directly with thyroid receptor? [J]. Journal of Applied Toxicology, 2011, 31(2): 179-184

[34]Vuong A M, Webster G M, Romano M E, et al. Maternal polybrominated diphenyl ether (PBDE) exposure and thyroid hormones in maternal and cord sera: The HOME Study, Cincinnati, USA [J]. Environmental Health Perspectives, 2015, 123(10): 1079-1085

[35]Arkoosh M R, Gaest A L V, Strickland S A, et al. Alteration of thyroid hormone concentrations in juvenile Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) exposed to polybrominated diphenyl ethers, BDE-47 and BDE-99 [J]. Chemosphere, 2016, 171: 1-8

[36]Blanco J, Mulero M, López M, et al. BDE-99 deregulates BDNF, Bcl-2 and the mRNA expression of thyroid receptor isoforms in rat cerebellar granular neurons [J]. Toxicology, 2011, 290(2): 306-312

[37]Blanco J, Mulero M, Heredia L, et al. Perinatal exposure to BDE-99 causes learning disorders and decreases serum thyroid hormone levels and BDNF gene expression in hippocampus in rat offspring [J]. Toxicology, 2013, 308(2): 122-128

[38]Yu L, Han Z, Liu C. A review on the effects of PBDEs on thyroid and reproduction systems in fish [J]. General & Comparative Endocrinology, 2015, 219: 64-73

[39]Lema S C, Dickey J T, Schultz I R, et al. Dietary exposure to 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) alters thyroid status and thyroid hormone: Regulated gene transcription in the pituitary and brain [J]. Environmental Health Perspectives, 2008, 116(12): 1694-1699

[40]Kuiper R V, Vethaak A D, Cantón R F, et al. Toxicity of analytically cleaned pentabromodiphenylether after prolonged exposure in estuarine European flounder (Platichthys flesus), and partial life-cycle exposure in fresh water zebrafish (Danio rerio) [J]. Chemosphere, 2008, 73(2): 195-202

[41]Yu L, Lam J C, Guo Y, et al. Parental transfer of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and thyroid endocrine disruption in zebrafish [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(24): 10652-10659

[42]Yu L, Liu C, Chen Q, et al. Endocrine disruption and reproduction impairment in zebrafish after long-term exposure to DE-71 [J]. Environmental Toxicology & Chemistry, 2014, 33(6): 1354-1362

[43]Li W, Zhu L, Zha J, et al. Effects of decabromodiphenyl ether (BDE-209) on mRNA transcription of thyroid hormone pathway and spermatogenesis associated genes in Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Environmental Toxicology, 2014, 29(1): 1-9

[44]Liu C, Zhang X, Deng J, et al. Effects of prochloraz or propylthiouracil on the cross-talk between the HPG, HPA, and HPT axes in zebrafish [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(2): 769-775

[45]De G B, Van d G S, Darras V M, et al. Role of corticotropin-releasing hormone as a thyrotropin-releasing factor in non-mammalian vertebrates [J]. General and Comparative Endocrinology, 2006, 146(1): 62-68

[46]Liu C, Yu H, Zhang X. Zebrafish embryos/larvae for rapid determination of effects on hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) and hypothalamic-pituitary-interrenal (HPI) axis: mRNA expression [J]. Chemosphere, 2013, 93(10): 2327-2332

[47]Elsalini O A, von Gartzen J, Cramer M, et al. Zebrafish hhex, nk2.1a, and pax2.1 regulate thyroid growth and differentiation downstream of Nodal-dependent transcription factors [J]. Developmental Biology, 2003, 263(1): 67-80

[48]Ma Z, Song T, Su G, et al. Effects of tris (2-butoxyethyl) phosphate (TBOEP) on endocrine axes during development of early life stages of zebrafish (Danio rerio) [J]. Chemosphere, 2016, 144: 1920-1927

[49]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408

[50]Huang F, Wen S, Li J, et al. The human body burden of polybrominated diphenyl ethers and their relationships with thyroid hormones in the general population in Northern China [J]. Science of the Total Environment, 2014, 466-467(1): 609-615

[51]Wang K L, Hsia S M, Mao I F, et al. Effects of polybrominated diphenyl ethers on steroidogenesis in rat Leydig cells [J]. Human Reproduction, 2011, 26(8): 2209-2217