測(cè)定化學(xué)物對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制毒性的微板吸光法研究

陶珊珊，葛會(huì)林，袁宏球，陽(yáng)辛鳳

1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101 2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

近代化學(xué)物質(zhì)(農(nóng)藥、醫(yī)用藥品、工業(yè)用品、生活用品等)使用日益增多，各方面污染殘留情況日益嚴(yán)重，加強(qiáng)污染物殘留與毒性檢測(cè)技術(shù)的研究受到越來(lái)越多的重視。污染物檢測(cè)方法主要有儀器分析、生物檢測(cè)和酶抑制法等。儀器分析法主要有氣相色譜、液相色譜以及與質(zhì)譜的聯(lián)用方法等。生物檢測(cè)一般使用細(xì)菌、細(xì)胞、藻類(lèi)、魚(yú)等活體生物來(lái)表征污染物的毒性。酶抑制法一般通過(guò)污染物對(duì)各種酶如乙酰膽堿酯酶、辣根過(guò)氧化酶、熒光素酶[1]等的抑制來(lái)表征污染物毒性。生物檢測(cè)與酶抑制法具有儀器分析法無(wú)可替代的特點(diǎn)是可用于表征混合污染物的綜合毒性。酶抑制法相比生物檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、測(cè)試時(shí)間短等特點(diǎn)。

乙酰膽堿酯酶(AChE)最常用于酶抑制法當(dāng)中，其基本原理是AChE催化底物乙酰膽堿(ATCh)水解得到膽堿，膽堿與顯色劑二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)，生成黃色物質(zhì)5-硫代-2-硝基-苯甲酸，通過(guò)在412 nm檢測(cè)此黃色物質(zhì)的吸光度變化來(lái)反映酶催化反應(yīng)的變化[2]。有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)AChE功能有抑制作用，反應(yīng)生成共價(jià)結(jié)合的磷酰化膽堿酯酶或可水解的氨基甲酰化膽堿酯酶，抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，可通過(guò)抑制毒性來(lái)判斷出樣品中是否有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的存在以及殘留情況[3-4]。

AChE抑制法應(yīng)用廣泛且成效顯著，是一種相對(duì)成熟的檢測(cè)方法[5]，可用于各種AChE抑制劑的篩選[6-8]，以及部分農(nóng)藥殘留的檢測(cè)[9]。如AChE抑制法用于蔬菜、水果、茶葉中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留檢測(cè)[10]，并制定了相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。目前的形勢(shì)是需檢的污染物數(shù)目及種類(lèi)越來(lái)越多，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測(cè)任務(wù)越來(lái)越繁重，所以AChE抑制法還需要進(jìn)一步的簡(jiǎn)化、優(yōu)化與高通量化。

酶抑制實(shí)驗(yàn)的影響因素較多，如pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶的敏感性等，前人已進(jìn)行了一些影響因素的條件優(yōu)化研究[11-13]。王小紅[14]觀察到辛硫磷、敵敵畏、樂(lè)果在45 ℃對(duì)植物酯酶的抑制作用最大。侯學(xué)文等[15]使用碘化硫代丁酰膽堿作為底物，觀察到某膽堿酯酶對(duì)辛硫磷十分敏感。但少有人研究AChE、DTNB、ATCh濃度對(duì)污染物抑制AChE毒性測(cè)定的影響。

AChE抑制法通常使用比色管分光光度法測(cè)定，這一定程度上制約了其進(jìn)行多次重復(fù)，也不利于實(shí)現(xiàn)高通量操作，而且需要消耗大量的試劑藥品。環(huán)境介質(zhì)中農(nóng)藥的存在形式一般是低劑量與混合殘留[16-17]，為了從單個(gè)污染物預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)混合物毒性，需要準(zhǔn)確測(cè)定單個(gè)污染物的低劑量效應(yīng)與全局劑量-效應(yīng)曲線(DRC)，這就需要增加試驗(yàn)的次數(shù)與重復(fù)性，而使用比色管法無(wú)法滿(mǎn)足這樣的要求。

微孔板具有可高通量操作、易于多次重復(fù)、所需試樣體積少等特點(diǎn)，目前越來(lái)越多地用于污染物毒性檢測(cè)，微孔板可作為酶[1]、發(fā)光菌[18]甚至線蟲(chóng)[19]的暴露反應(yīng)載體。滅多威作為一種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，施用后殘留于環(huán)境形成污染物[20]，本研究以其為例，研究AChE、ATCh、DTNB濃度對(duì)滅多威毒性測(cè)定的影響，最終建立穩(wěn)定、重復(fù)性好、可高通量操作的AChE抑制法，同時(shí)與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比與驗(yàn)證，為今后AChE抑制法的應(yīng)用與研究提供參考和方法支持。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　儀器與試劑

Synergy2型多功能微孔板測(cè)定儀(美國(guó)BioTek公司)，AL204型四位電子天平(梅特勒-托利多公司)，雷磁PHS-3E型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，96孔透明微板(Corning 9018)。

用于AChE催化體系顯色的物質(zhì)包括碘化硫代乙酰膽堿ATCI(aladdin，純度98%，CAS號(hào)1866-15-5)、DTNB(Vetec，純度98%，CAS號(hào)69-78-3)、電鰻AChE(Sigma，C3389-2kU，CAS號(hào)9000-81-1)。DTNB、ATCI和AChE溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(含0.025 mol·L-1KH2PO4與0.025 mol·L-1Na2HPO4·12H2O)并避光保存于4 ℃冰箱中。為溶解DTNB，參考文獻(xiàn)[2]，每克DTNB添加0.379 g的NaHCO3。受試化合物滅多威(Chem Service，純度99.1%，CAS號(hào)16752-77-5)也溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖液并避光保存于4 ℃冰箱中。

1.2　乙酰膽堿酯酶體系組分濃度對(duì)顯色的影響

進(jìn)行化學(xué)物對(duì)AChE的毒性試驗(yàn)之前，需要了解不同因素對(duì)AChE催化體系顯色的影響。本研究采用空調(diào)控溫(29±1) ℃，影響顯色因素實(shí)驗(yàn)的吸光度均為反應(yīng)15 min時(shí)在412 nm波長(zhǎng)測(cè)定。通過(guò)固定AChE、DTNB和ATCI其中2種物質(zhì)的濃度，改變另一種物質(zhì)的濃度，研究其與顯色的關(guān)系。其中變化濃度的組分每個(gè)濃度8次重復(fù)且加入體積為100 μL，濃度不變的組分加入體積為50 μL。DTNB與ATCI濃度為0.25 g·L-1時(shí)，各列AChE濃度依次為1、0.7、0.49、0.34、0.24、0.17、0.12、0.082、0.058、0.04、0.028、0.02 U·mL-1；ATCI濃度為0.25 g·L-1，AChE濃度為0.05 U·mL-1，各列DTNB濃度依次為5、2.5、1.25、0.65、0.315、0.155、0.08、0.039、0.0195、0.01、0.005 g·L-1；DTNB濃度為0.25 g·L-1，AChE濃度為0.05 U·mL-1，各列ATCI濃度依次為5、2.5、1.25、0.65、0.315、0.155、0.08、0.039、0.0195、0.01、0.005 g·L-1。

1.3　乙酰膽堿酯酶微板毒性分析

參考發(fā)光菌的微板毒性分析[18]，建立乙酰膽堿酯酶的微板毒性分析程序如下。將96孔微板第12列的8個(gè)孔加入100 μL磷酸鹽緩沖液作為空白對(duì)照，其余11列加入按一定稀釋因子設(shè)計(jì)的11個(gè)濃度梯度污染物100 μL，每個(gè)濃度8個(gè)重復(fù)，接著每孔依次加入50 μL 1 g·L-1DTNB、50 μL 1 g·L-1ATCI與 50 μL 0.2 U·mL-1AChE，每孔總體積共250 μL，然后將微板送入酶標(biāo)儀中測(cè)定吸光度(A)，默認(rèn)的暴露時(shí)間為15 min。

污染物對(duì)AChE的抑制毒性E按照公式(1)計(jì)算，得到的劑量-效應(yīng)曲線(DRC)使用公式(2)所示W(wǎng)eibull函數(shù)進(jìn)行最小二乘法擬合，并計(jì)算觀測(cè)值的95%置信區(qū)間[21]，得到典型效應(yīng)濃度如EC90、EC50、EC10等。

E=1-△At/△Ac

(1)

E=1-exp(-exp(a+b×log10(C)))

(2)

式中ΔAt為與0 min相比處理吸光度變化值，ΔAc為與0 min相比空白吸光度變化值，C為濃度，E為效應(yīng)，a為位置參數(shù)，b為斜率參數(shù)。

1.4　污染物抑制乙酰膽堿酯酶毒性的影響因素

為研究暴露時(shí)間對(duì)污染物抑制AChE的影響，測(cè)定暴露時(shí)間為5、10、15、20、25、30 min時(shí)滅多威抑制AChE的DRC。

通過(guò)固定AChE、ATCI、DTNB其中2種物質(zhì)的濃度，改變另一種物質(zhì)的濃度，測(cè)定滅多威抑制AChE 15 min的DRC，研究AChE、ATCI、DTNB濃度對(duì)滅多威抑制AChE的影響。其中DTNB與ATCI濃度為0.2 g·L-1時(shí)，AChE濃度選取0.004、0.01、0.04、0.16 U·mL-1；ATCI濃度為0.2 g·L-1，AChE濃度為0.04 U·mL-1，DTNB濃度選取0.02、0.2、2 g·L-1；DTNB濃度為0.2 g·L-1，AChE濃度為0.04 U·mL-1，ATCI的濃度選取0.02、0.2、2 g·L-1。

1.5　方法驗(yàn)證

以國(guó)標(biāo)GB/T 5009.199—2003[22]中的酶抑制法(此后簡(jiǎn)稱(chēng)國(guó)標(biāo)法)作為參考對(duì)本研究方法進(jìn)行驗(yàn)證。國(guó)標(biāo)法中，采用pH 8.0的KH2PO4-K2HPO4緩沖液，DTNB與AChE用緩沖液配制，每克DTNB添加0.0975 g的NaHCO3，ATCI用純水配制，反應(yīng)溶液中ATCI與DTNB的終濃度分別為0.298 g·L-1與0.286 g·L-1；AChE濃度沒(méi)有明確指定，此處采用0.04 U·mL-1。檢測(cè)方式為2.5 mL樣品溶液，加入0.1 mL AChE、0.1 mL DTNB，搖勻后于37 ℃放置最少15 min，再加入0.1 mL ATCI，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值。為與微板法對(duì)比，將國(guó)標(biāo)法換算后移植到微板上進(jìn)行，加樣體積為處理/空白100 μL+AChE 50 μL+DTNB 50 μL+ATCI 50 μL。因?yàn)閲?guó)標(biāo)法測(cè)試分溫浴和顯色2個(gè)階段，加樣順序會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果有影響。所以我們?cè)O(shè)計(jì)了板(36)的AChE+DTNB+ATCI (稱(chēng)國(guó)標(biāo)法)、板(37)的AChE+ATCI+DTNB (稱(chēng)國(guó)標(biāo)法變異1)、板(38)的DTNB+ATCI+AChE (稱(chēng)國(guó)標(biāo)法變異2)3種加樣順序；3種物質(zhì)中前兩者37 ℃溫浴15 min，再加第3種物質(zhì)顯色并在37 ℃測(cè)試；相應(yīng)地暴露時(shí)間表示為溫浴時(shí)間(15 min)加上實(shí)際顯色時(shí)間，但國(guó)標(biāo)法變異2的溫浴時(shí)間不算在暴露時(shí)間內(nèi)。

2　結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1　乙酰膽堿酯酶體系組分濃度對(duì)顯色吸光度的影響

圖1(a)為不同AChE濃度下的吸光度曲線，可以看出隨著AChE濃度(0.02～1 U·mL-1)的增加，吸光度相應(yīng)增加，從0.173到2.212。類(lèi)似地，余淑英等[23]報(bào)道AChE濃度在0～0.0667 U·mL-1范圍與吸光度保持良好的線性關(guān)系，并建議反應(yīng)體系酶終濃度應(yīng)控制在0.0667 U·mL-1以?xún)?nèi)。圖1(b)為不同DTNB濃度下的吸光度曲線，隨著DTNB濃度(0.005～5 g·L-1)的增加，吸光度也相應(yīng)增加，從0.138到1.332。圖1(c)為不同ATCI濃度下的吸光度曲線，隨著ATCI濃度(0.005～5 g·L-1)的增加，吸光度也相應(yīng)增加，從0.138到1.834。有研究表明，ATCh濃度與吸光度存在雙相關(guān)系[24]，轉(zhuǎn)折點(diǎn)對(duì)應(yīng)的ATCh濃度約3.3 mmol·L-1(即0.95 g·L-1的ATCI)。本研究中沒(méi)有觀察到ATCI濃度對(duì)吸光度的雙相關(guān)系，原因有待進(jìn)一步研究。

2.2　乙酰膽堿酯酶體系組分濃度對(duì)顯色吸光度變化速率的影響

將圖1中15 min測(cè)定的A值分別減去0 min的A值，所得差值除以15 min即為吸光度的變化速率(ΔA·min-1)，可以看出AChE、DTNB與ATCI濃度與吸光度變化速率呈現(xiàn)出完全不同類(lèi)型的曲線(圖2)。隨著AChE濃度的增加，吸光度變化速率呈現(xiàn)遞增的曲線(圖2a)。隨著DTNB濃度的增加，吸光度變化速率呈現(xiàn)基本水平的曲線(圖2b)，每分鐘A值的變化量約為0.004。而隨著ATCI濃度的增加，吸光度變化速率呈現(xiàn)先增后減的雙相曲線(圖2c)，最大值出現(xiàn)在ATCI濃度為0.315 g·L-1(即1.09 mmol·L-1)，這反映了AChE的過(guò)量底物抑制效應(yīng)；建議采用上升階段曲線，ATCI的濃度以小于0.315 g·L-1為宜。Ellman等[2]報(bào)道牛紅細(xì)胞膽堿酯酶催化乙酰膽堿水解速率也呈現(xiàn)先增后減的雙相曲線，其最大值出現(xiàn)在乙酰膽堿濃度約為0.5 mmol·L-1。但丁酰膽堿酯酶(BChE)無(wú)過(guò)量底物抑制效應(yīng)，如雞血清BChE[9]，這也是區(qū)分AChE和BChE的特性之一[25]。

圖1　影響乙酰膽堿酯酶催化體系顯色吸光度的因素注：(a) 乙酰膽堿酯酶(AChE)濃度；(b) 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)濃度；(c) 碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)濃度。Fig. 1　Factors affecting the absorbance of AChE catalytic systemNote: (a) acetylcholinesterase (AChE) concentration; (b) 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) concentration; (c) acetylthiocholine iodide (ATCI) concentration.

圖2　影響乙酰膽堿酯酶催化體系顯色吸光度變化速率的因素Fig. 2　Factors affecting the change rate of absorbance of AChE catalytic system

2.3　污染物抑制乙酰膽堿酯酶的影響因素研究

圖3(a)為不同暴露時(shí)間下滅多威的DRC，可以看出隨著暴露時(shí)間的增加滅多威DRC向左移動(dòng)，滅多威的毒性隨之增大，表1中EC50隨之減小，5、15、30 min時(shí)分別為5.08×10-6、2.41×10-6、1.60×10-6mol·L-1。可以看出15 min后毒性變化已不大，考慮試驗(yàn)效率等因素并參考慣例，選擇15 min作為毒性測(cè)試默認(rèn)的暴露時(shí)間。

圖3(b)為AChE濃度為0.004、0.01、0.04、0.16 U·mL-1時(shí)滅多威的DRC，這4條DRC基本重合，表明一定范圍內(nèi)AChE濃度變化不會(huì)對(duì)污染物的毒性測(cè)試產(chǎn)生影響。李維[9]也發(fā)現(xiàn)不同比酶活力的雞血清BChE對(duì)農(nóng)藥的抑制率基本相同。圖3(c)為DTNB濃度為0.02、0.2、2 g·L-1時(shí)滅多威的DRC，這3條DRC基本重合，表明一定范圍內(nèi)DTNB濃度變化也不會(huì)對(duì)污染物的毒性測(cè)試產(chǎn)生影響。

表1　滅多威抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)模型及相關(guān)參數(shù)Table 1　Dose-response model of methomyl inhibiting acetylcholinesterase and related parameters

注：T為暴露時(shí)間，單位為min；CAChE為反應(yīng)溶液中的AChE濃度，單位為U·mL-1；CDTNB與CATCI為反應(yīng)溶液中DTNB與ATCI的濃度，單位為g·L-1；a與b為Weibull模型的位置與斜率參數(shù)；R2為擬合決定系數(shù)；RMSE為均方根誤差；EC10、EC50、EC90為產(chǎn)生10%、50%、90%效應(yīng)的濃度，單位為mol·L-1。

Note: T is the exposure time with the unit minute; CAChEis the concentration of AChE in the reaction solution with the unit U·mL-1; CDTNBand CATCIare the concentrations of DTNB and ATCI in the reaction solution with the unit g·L-1; a and b are the location parameter and slope parameter for Weibull model; R2is the fitting coefficient of determination; RMSE is the root mean square error; EC10,EC50and EC90are the 10%, 50% and 90% effect concentration with the unit mol·L-1.

圖3(d)為不同ATCI濃度下滅多威的DRC，可見(jiàn)隨著ATCI濃度的增大，DRC向右大幅度移動(dòng)。滅多威的毒性隨著ATCI濃度的增大而減小，其EC50在ATCI濃度為0.02、0.2、2 g·L-1時(shí)分別為6.75×10-7、2.26×10-6、1.12×10-5mol·L-1，其中最大值是最小值的16.6倍，所以ATCI濃度變化能顯著影響污染物對(duì)AChE的抑制毒性。所以，ATCI濃度是決定化學(xué)物抑制AChE毒性的關(guān)鍵參數(shù)，不同文獻(xiàn)中若ATCI濃度不一樣，得到的化學(xué)物抑制AChE的EC50一般是沒(méi)有可比性的，這對(duì)于AChE抑制法的研究與應(yīng)用具有重要的參考意義。此結(jié)果一個(gè)潛在的含義是可通過(guò)改變ATCI濃度來(lái)調(diào)控污染物抑制AChE毒性的大小，ATCI作用類(lèi)似于一個(gè)化學(xué)探針，為使毒性指標(biāo)更靈敏，在保證重復(fù)性的前提下，可適當(dāng)降低ATCI的濃度。可以預(yù)計(jì)熒光素酶毒性試驗(yàn)中[1]，三磷酸腺苷(ATP)也有類(lèi)似于ATCI的作用，ATP濃度變化應(yīng)能顯著影響化學(xué)物對(duì)熒光素酶的毒性。反而AChE濃度不影響滅多威毒性測(cè)試結(jié)果。文獻(xiàn)報(bào)道滅多威是與AChE活性位點(diǎn)以外的部位結(jié)合，為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，主要通過(guò)改變酶分子的形狀而產(chǎn)生抑制[26]。同時(shí)，滅多威對(duì)AChE的抑制作用是可逆的[27-28]。從研究結(jié)果、試劑成本因素等方面綜合考慮，確定最終優(yōu)化實(shí)驗(yàn)濃度為DTNB 0.2 g·L-1、ATCI 0.2 g·L-1與AChE 0.04 U·mL-1。優(yōu)化的酶濃度也在文獻(xiàn)[23]建議的濃度范圍內(nèi)。

2.4　方法驗(yàn)證與總結(jié)

從圖3(e)與表1可以看出，板(38)的國(guó)標(biāo)法變異2與板(3)的本研究方法所測(cè)結(jié)果基本一致，板(38)所測(cè)EC50是板(3)1.32倍，國(guó)標(biāo)法變異2與本研究方法結(jié)果基本是等同的，兩者具有相近的穩(wěn)定性與靈敏度。板(39)為采用國(guó)標(biāo)法中的溶液濃度，加樣順序按照本研究方法DTNB+ATCI+AChE，并立即在29 ℃檢測(cè)。可以看出板(38)在37 ℃所測(cè)EC50是板(39)在29 ℃的1.04倍，幾乎完全一樣，所以AChE酶抑制法對(duì)于溫度是不敏感的。板(39)所測(cè)EC50是板(3)的1.27倍，所以pH在一定范圍內(nèi)如6.8～8.0對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響不大。板(38)與(39)所測(cè)DRC隨時(shí)間增加向左移動(dòng)，與板(3)的變化規(guī)律一致。但是，板(36)的國(guó)標(biāo)法與板(37)的國(guó)標(biāo)法變異1與板(3)的本研究方法所測(cè)結(jié)果差異顯著，板(3)的15 min的EC50分別是板(36)、(37)的(15+3) min的EC50的19.8、3.1倍！板(36)所測(cè)毒性也遠(yuǎn)較板(37)大，我們認(rèn)為主要與板(36)溫浴15 min的暴露過(guò)程中沒(méi)有ATCI與滅多威競(jìng)爭(zhēng)酶作用位點(diǎn)有關(guān)。相比板(3)，板(36)與(37)溫浴15 min過(guò)程中雖然已處于暴露階段，但抑制率只能在顯色后的時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，這可稱(chēng)為瞬時(shí)抑制率，而板(3)可稱(chēng)為平均抑制率，這一定程度上可能導(dǎo)致板(3)所測(cè)毒性偏小。圖3(f)顯示板(36)所測(cè)DRC隨時(shí)間增加向右移動(dòng)，圖3(g)表明板(37)所測(cè)DRC基本不移動(dòng)，這與板(3)所測(cè)DRC左移即人們通常認(rèn)為的一段時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間增加而毒性增加的規(guī)律是有差異的。以EC90/EC10來(lái)表示毒物發(fā)揮毒性效應(yīng)的范圍，從表1可以看出，隨著時(shí)間增加，板(3)與(36)的此范圍不斷加寬，但板(37)的范圍不斷變窄。

圖3　影響滅多威抑制乙酰膽堿酯酶劑量-效應(yīng)曲線的因素注：(a, f, g) 暴露時(shí)間；(b) AChE濃度；(c) DTNB濃度；(d) ATCI濃度；(e) 試劑加樣順序。Fig. 3　Factors affecting the dose-response curves of methomyl inhibiting acetylcholinesteraseNote: (a, f, g) Exposure time; (b) AChE concentration; (c) DTNB concentration; (d) ATCI concentration; (e) Reagent injection sequence.

圖4為3種典型加樣順序條件下滅多威抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)曲線。國(guó)標(biāo)法(圖4a)具有最高的靈敏度，適合于農(nóng)藥低劑量殘留等的檢測(cè)。國(guó)標(biāo)法變異1(圖4b)的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)試毒性對(duì)時(shí)間因素不敏感，適合于要求結(jié)果高穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)。我們研究方法(圖4c)的特點(diǎn)是更符合生物體中AChE與ATCh同時(shí)存在的特征，同時(shí)測(cè)試方法能全面完整反映暴露全過(guò)程的毒性變化。

綜合來(lái)看，AChE抑制率與滅多威濃度成S型DRC關(guān)系，可用Weibull函數(shù)有效表征，擬合決定系數(shù)R2>0.97，擬合均方根誤差RMSE<0.07，空白變異控制在了±10%以?xún)?nèi)。滅多威毒性測(cè)試結(jié)果重復(fù)性較好，低濃度毒性變化趨勢(shì)較為合理，DRC曲線覆蓋范圍全面。這與文獻(xiàn)[1]中熒光素酶毒性測(cè)試結(jié)果的重復(fù)性相當(dāng)。基于比色管分光光度的國(guó)標(biāo)法[22]中，以E≥50%作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，滅多威的檢出限為6.16×10-7mol·L-1；本研究中基于微板分光光度的國(guó)標(biāo)法的EC50為1.22×10-7，后者相比前者具有更高的靈敏度。但本文提出的方法尚需要進(jìn)一步開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)化研究，通過(guò)與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行平行比較研究，進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性。

通過(guò)研究可以看出，影響污染物抑制AChE的因素主要有ATCI濃度的準(zhǔn)確性、污染物濃度的準(zhǔn)確性、試劑加樣順序等。不同污染物在不同pH條件下的穩(wěn)定性不同，在保證酶活性較高的情況下，本試驗(yàn)使用磷酸鹽緩沖液控制反應(yīng)體系pH值6.8，能最大程度適合大多數(shù)污染物的毒性測(cè)試。使用空調(diào)控溫反應(yīng)在(29±1) ℃，不需要額外的控溫手段，操作更加簡(jiǎn)單便利。AChE微板毒性分析，使用稀釋因子得到等對(duì)數(shù)間距濃度污染物，能保證效應(yīng)從高到低完整覆蓋DRC的有效范圍。ATCI加入體積占每孔總體積的1/5，保證了ATCI濃度的準(zhǔn)確性，以及每個(gè)處理的8次重復(fù)，都保證了DRC測(cè)試的有效重復(fù)。本研究建立的AChE微板毒性分析法，一塊微板，一次測(cè)定，即得到樣品一條完整的劑量-效應(yīng)曲線，具有操作程序化、普適化、高通量、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn)，適合環(huán)境污染物毒性的高通量測(cè)試，也可用于AChE抑制劑的篩選等工作。

圖4　3種典型加樣順序下滅多威抑制乙酰膽堿酯酶的劑量-效應(yīng)曲線注：□，空白控制；○，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；—，Weibull模型擬合曲線；┄，置信區(qū)間。Fig. 4　Dose-response curves of methomyl inhibiting acetylcholinesterase at three typical injection sequencesNote: □, Blank Control; ○, Experimental data; —, Weibull model fit; ┄, Confidence interval.

致謝：感謝中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所賈瑞宗博士在文章修改中給予的幫助。感謝審稿人對(duì)文章提出的有建設(shè)性的修改意見(jiàn)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]葛會(huì)林, 劉樹(shù)深, 陳浮, 等. 測(cè)定化學(xué)物對(duì)螢光素酶抑制毒性的微板發(fā)光法研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2013(10): 2766-2770

Ge H L, Liu S S, Chen F, et al. Microplate luminometry for toxicity bioassay of chemicals on luciferase [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2013(10): 2766-2770 (in Chinese)

[2]Ellman G L, Courtney K D, Andres V, et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95

[3]杜美紅, 孫永軍, 汪雨, 等. 酶抑制-比色法在農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(17): 462-466

Du M H, Sun Y J, Wang Y, et al. Advances in the application of enzyme inhibition/colorimetric assay to the rapid detection of pesticide residues [J]. Food Science, 2010, 31(17): 462-466 (in Chinese)

[4]朱巖, 王飛飛, 張亞輝, 等. 3種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)水生生物的乙酰膽堿酯酶抑制效應(yīng)的物種敏感度分析初探[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2016, 11(3): 211-218

Zhu Y, Wang F F, Zhang Y H, et al. A preliminary study on species sensitivity analysis of inhibition effect of three organophosphorus pesticides on acetylcholinesterase in aquatic organisms [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(3): 211-218 (in Chinese)

[5]Pohanka M, Musilek K, Kuca K. Progress of biosensors based on cholinesterase inhibition [J]. Current Medicinal Chemistry, 2009, 16(14): 1790-1798

[6]Pang Y P, Quiram P, Jelacic T, et al. Highly potent, selective, and low cost bis-tetrahydroaminacrine inhibitors of acetylcholinesterase-steps toward novel drugs for treating Alzheimer's disease [J]. Journal of Biological Chemistry, 1996, 271(39): 23646-23649

[7]Ibach B, Haen E. Acetylcholinesterase inhibition in Alzheimer's disease [J]. Current Pharmaceutical Design, 2004, 10(3): 231-251

[8]Ferreira A, Proen?a C, Serralheiro M L, et al. The in vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from portugal [J]. Journal of Ethnopharmacology, 2006, 108(1): 31-37

[9]李維. 雞血清丁酰膽堿酯酶分離純化與農(nóng)藥敏感性研究[D]. 成都: 西華大學(xué), 2014: 25-33

Li W. Study on isolation, purification and pesticide sensitivity of buturylcholinesterases from chicken serum [D]. Chengdu: Xihua University, 2014: 25-33 (in Chinese)

[10]李曉婷, 王紀(jì)華, 朱大洲, 等. 果蔬農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2011, 27(S2): 363-370

Li X T, Wang J H, Zhu D Z, et al. Research progress of fast detection methods of fruits and vegetables pesticide residues [J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural, 2011, 27(S2): 363-370 (in Chinese)

[11]廖秀麗, 羅術(shù)東, 伍翔, 等. 小峰熊蜂頭部乙酰膽堿酯酶測(cè)定條件的優(yōu)化及其對(duì)六種常用殺蟲(chóng)劑的敏感性[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2011, 54(12): 1361-1367

Liao X L, Luo S D, Wu X, et al. Optimization of conditions for assaying activity of acetylcholinesterase in Bombus hypocrita (Hymenoptera: Apidae) and its sensitivity to six common insecticides [J]. Acta Entomologica Sinica, 2011, 54(12): 1361-1367 (in Chinese)

[12]邱朝坤, 劉曉宇, 林曉娜, 等. 鯽魚(yú)乙酰膽堿酯酶酶活測(cè)定條件的優(yōu)化研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8): 425-429

Qiu Z K, Liu X Y, Lin X N, et al. Study on optimization of conditions for analyzing activity of acetylcholinesterase derived from crucian [J]. Food Science, 2008, 29(8): 425-429 (in Chinese)

[13]Ensibi C, Hernández-Moreno D, Míguez Santiyán M P, et al. Effects of carbofuran and deltamethrin on acetylcholinesterase activity in brain and muscle of the common carp [J]. Environmental Toxicology, 2014, 29(4): 386-393

[14]王小紅. 酶抑制法檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006: 31-32

Wang X H. Study on methods based on enzyme inhibition principle of determination to organophosphorus residue [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2006: 31-32 (in Chinese)

[15]侯學(xué)文, 何衍彪, 徐漢虹. 膽堿酯酶抑制法檢測(cè)辛硫磷農(nóng)藥殘留[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 27(2): 181-184

Hou X W, He Y B, Xu H H. A method to detect phoxim residue by analyzing the inhibition of cholinesterase [J]. Journal of Hebei Normal University, 2003, 27(2): 181-184 (in Chinese)

[16]Silva E, Rajapakse N, Kortenkamp A. Something from “nothing” - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects [J]. Environmental Science & Technology, 2002, 36(8): 1751-1756

[17]汪鵬鵬, 張松林, 靳佳, 等. 辛硫磷和敵百蟲(chóng)協(xié)同抑制斑馬魚(yú)乙酰膽堿酯酶(AChE)活性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2017, 12(1): 298-304

Wang P P, Zhang S L, Jin J, et al. Phoxim and trichlorfon synergistically reduce acetylcholinesterase (AChE) activity of zebrafish (Brachydanio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(1): 298-304 (in Chinese)

[18]劉保奇, 葛會(huì)林, 劉樹(shù)深. 測(cè)定環(huán)境污染物對(duì)青海弧菌發(fā)光強(qiáng)度抑制的微板發(fā)光法研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2006, 11(2): 186-191

Liu B Q, Ge H L, Liu S S. Microplate luminometry for toxicity bioassay of environmental pollutant on a new type of fresh water luminescent bacterium (Vibrio-qinghaiensis sp.- Q67) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2006, 11(2): 186-191 (in Chinese)

[19]梁爽, 于振洋, 尹大強(qiáng). 環(huán)境濃度下磺胺混合物對(duì)秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)生長(zhǎng)、飲食、抗氧化酶及其調(diào)控基因表達(dá)水平的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(4): 88-95

Liang S, Yu Z Y, Yin D Q. Effects of sulfonamide mixtures at environmental concentrations on growth, feeding, catalase activity and the gene expression levels of Caenorhabditis elegans [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(4): 88-95 (in Chinese)

[20]Wilson P C, Foos J F. Survey of carbamate and organophosphorous pesticide export from a South Florida (USA) agricultural watershed: Implications of sampling frequency on ecological risk estimation [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2006, 25(11): 2847-2852

[21]朱祥偉, 劉樹(shù)深, 葛會(huì)林, 等. 劑量-效應(yīng)關(guān)系兩種置信區(qū)間的比較[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2009, 29(2): 113-117

Zhu X W, Liu S S, Ge H L, et al. Comparision between two confidence intervals of dose-response relationships [J]. China Environmental Science, 2009, 29(2): 113-117 (in Chinese)

[22]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部, 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸醋類(lèi)農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2004

Ministry of Health of the People's Republic of China, National Standardization Administration of China. GB/T 5009.199-2003 Rapid determination for organophosphate and carbamate pesticide residues in vegetables [S]. Beijing: China Standard Press, 2004 (in Chinese)

[23]余淑英, 盧艷, 王星麗, 等. 金針菇乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選條件的優(yōu)化與應(yīng)用[J]. 食藥用菌, 2017, 25(1): 34-39

Yu S Y, Lu Y, Wang X L, et al. Optimization and application of acetylcholinesterase inhibitor screening criteria from the fruiting body of Flammulina velutipes [J]. Edible and Medicinal Mushrooms, 2017, 25(1): 34-39 (in Chinese)

[24]杜曉華. 觀賞植物馬尾杉內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物對(duì)AChE的抑制活性[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2003: 23-24

Du X H. Endophytes from Phlegmariurus carinatus and their second metabolites inhibition AChE activity [D]. Yangling: Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, 2003: 23-24 (in Chinese)

[25]丁運(yùn)華, 陳勇智. 用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留的膽堿酯酶酶源的研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 27(5): 73-77

Ding Y H, Chen Y Z. Advances on sources of cholinesterase for pesticides residue determination [J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2007, 27(5): 73-77 (in Chinese)

[26]趙飛. 滅多威對(duì)乙酰膽堿酯酶及大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響[D]. 武漢: 華中科技大學(xué), 2015: 20-21

Zhao F. Effects of methomyl on acetylcholinesterase and nervous system in rats [D]. Wuhan: Huazhong University of Science and Technology, 2015: 20-21 (in Chinese)

[27]Hastings F L, Main A R, Iverson F. Carbamylation and affinity constants of some carbamate inhibitors of acetylcholinesterase and their relation to analogous substrate constants [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1970, 18(3): 497-502

[28]Makrides C, Koukouvas M, Achillews G, et al. Methomyl-induced severe acute pancreatitis: Possible etiological association [J]. Journal of the Pancreas, 2005, 6(2): 166-171