鹽度脅迫對泥蚶存活率及3種酶活力的影響

李　敏，鄭伊諾，許凱倫，曾國權，陸榮茂，胡　園*

(1.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江 溫州　325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州　325005)

近年來，干旱、暴雨頻發等自然因素以及人為因素的影響給灘涂貝類的生存環境帶來巨大改變，其中鹽度受環境的變化更顯著。鹽度是影響貝類分布和生理代謝最重要的生態因子之一，在不同地理環境中分布的貝類，其可耐受的鹽度范圍不同，因而鹽度的變化對貝類的生理活動會造成一定影響[1-5]。一般而言，海水的鹽度直接影響貝類體內的滲透壓，當海水鹽度改變時，為適應環境，機體需重新平衡體內外的水鹽系統，消耗能量，貝類的正常生長就會受到影響，只有在一定的鹽度范圍內，水生動物的生長才能達到最大速度。

泥蚶(Tegillarcagranosa)隸屬軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，蚶屬(Tegillarca)，是潮間帶中重要的養殖種類。目前，在溫度、重金屬等脅迫對泥蚶影響的研究方面已有報道[6-8]，但是有關鹽度脅迫對泥蚶基礎生理代謝的研究資料不多。本試驗以泥蚶為研究對象，研究了鹽度脅迫下泥蚶血漿滲透壓、過氧化物酶(POD)活力、總超氧化物歧化酶(TSOD)活力及組織Na+/K+-ATP酶活力的變化規律，旨在為泥蚶的滲透生理調節及適應機制的研究提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1　材料

供試用泥蚶于2016年6月底購自浙江溫嶺。從中選擇活動能力正常、健康、個體大小均勻的泥蚶進行試驗，試驗選取的泥蚶平均殼長(3.43±0.07) cm，平均殼高(2.70±0.06) cm， 平均體重(15.63±0.80) g。

1.2　方法

1.2.1處理設計

本次試驗采取靜水系統，設定8個鹽度梯度，鹽度分別為0、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，另設置與貝類取樣區域海水鹽度相似的鹽度1.5%作為對照組，其他鹽度組為實驗組，各設3個平行組。通過加人工海水精鹽配制所需鹽度梯度，每隔24 h全量換水1次。2016年7月3—8日，每天取樣檢測1次。

1.2.2檢活方法

每天定時取出10只大小相近、活力相當的泥蚶置于常溫海水靜置1 h后，采用目測法檢活，即活泥蚶雙殼緊閉，絞合縫嚴密，用手掰不開，自動張口的稍一觸動即迅速閉合。

1.2.3樣品的制備

將泥蚶置于冰盤上，使用無菌注射器快速抽取血液，移入樣品管中冰浴，將血液置于低溫離心機，10 000 r·min-1速度下離心8 min，取上層液用以測定血漿滲透壓、POD活力及TSOD活力，樣品在24 h內分析完畢。

取樣品組織時，每次每組隨機取6只試驗泥蚶，將其置于冰盤上解剖，用預冷的0.86%生理鹽水清洗2次，除去血液，用干凈濾紙擦拭干凈后取出組織置于5 mL干凈的預冷的離心管中，加入預冷的0.86%生理鹽水制成組織勻漿液，再將勻漿液置于3 000 r·min-1速度下離心10 min，取上清液測定有關數值。

1.2.4樣品的測定

血漿滲透壓的測定：利用Model型冰點滲透壓計測定血漿滲透壓，血漿滲透壓單位用mOsm·kg-1表示。

酶活力的測定：POD活力、TSOD活力及Na+/K+-ATP酶活力的測定均采用南京建成生物研究所生產的試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進行。

血漿POD活力單位：每毫升血漿每分鐘催化1 μg底物的酶量為一個POD活力單位(U·mL-1)。

血漿TSOD活力單位：每毫升血漿在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U·mL-1)。

組織Na+/K+-ATP酶活力單位：每小時每毫克組織蛋白的組織中三磷酸腺苷酶分解三磷酸腺苷產生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位(U·mg-1)。

1.3　成活率的計算

成活率=(成活數/總數)×100。

1.4　數據處理

所有數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS 9.0分析軟件對實驗數據進行單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結果與分析

2.1　鹽度脅迫對泥蚶成活率的影響

由表1可以看出，不同鹽度脅迫對泥蚶的存活率的影響不同。試驗過程中，鹽度為3.5%、4.0%時，1 d內泥蚶的死亡率達到100%，鹽度為3.0%，2 d時全部死亡，這2組在1 d時存活率極顯著低于對照組。而鹽度為2.0%、2.5%時3 d的存活率與對照組基本相同，均為60%。試驗到4 d時0、0.5%、1.0% 3組存活率均為100%，到試驗結束時 3組的存活率為50%。由此可以看出，隨著時間的進行鹽度的變化對泥蚶存活率影響可表示為低鹽度組(0、0.5%、1.0%)>對照組(1.5%)和中鹽度組(2.0%、2.5%)>高鹽度組(3.0%、3.5%、4.0%)。

表1　鹽度脅迫下泥蚶的存活率　%

2.2　鹽度脅迫對泥蚶血漿滲透壓的影響

不同鹽度對泥蚶血漿滲透壓的影響見圖1，由圖1可以看出不同鹽度對泥蚶血漿滲透壓的影響不同，鹽度3.5%、4.0%在實驗1 d時血漿滲透壓達(1 332±10) mOsm·kg-1、(1 661±18) mOsm·kg-1，較開始分別增加了122.4%和177.3%，極顯著高于其他組；鹽度3.0%滲透壓隨著試驗的進行呈明顯上升趨勢，在2 d時滲透壓值最大，為(1 082±5) mOsm·kg-1，較開始增加了80.6%；鹽度2.0%、2.5%在3 d時滲透壓值最高，分別為(708±1) mOsm·kg-1、(1 026±44) mOsm·kg-1，較開始分別增加了18.2%和71.3%；對照組滲透壓值由試驗開始的(599±5) mOsm·kg-1，在1 d時先降低到最低值[(550±2) mOsm·kg-1]后增加，到試驗結束時達到(560±5) mOsm·kg-1；低鹽度的2個組(0、0.5%)，滲透壓值隨時間的增加而降低，分別較開始降低了42.2%、56.4%，均顯著低于對照組及其他實驗組。

圖1　不同鹽度對泥蚶血漿滲透壓的影響

2.3　鹽度脅迫對泥蚶血漿POD活力及TSOD活力的影響

不同鹽度對泥蚶血漿POD活力及TSOD活力影響見圖2，由圖2可知不同鹽度脅迫下各處理組POD活力不同，隨時間的增加鹽度3.5%、4.0%組POD活力顯著降低，分別由1 d的(62.63±2.00) U·mg-1、(63.78±0.88) U·mg-1降低至(28.30±4.87) U·mg-1、(24.52±2.09) U·mg-1，分別降低了54.8%、61.6%；低鹽度組均較1 d時增加且在第5天的值最高，分別為(60.78±9.92) U·mg-1、(74.44±6.41) U·mg-1、(76.37±9.91) U·mg-1，分別增加了4.1%、42.6%、43.5%；對照組及其他2組均呈先降后增趨勢，在2 d時降低至最低值。

圖2　　　　不同鹽度對泥蚶血漿POD活力及TSOD活力的影響

從圖2可以看出，不同鹽度脅迫下各處理組TSOD活力不同，試驗各組總體呈現下降趨勢，對照組TSOD活力由1 d時的(207.41±2.63) U·mL-1下降至(122.22±28.10) U·mL-1，下降了41.1%；鹽度0、0.5%、1.0%、2.0%泥蚶血漿TSOD活力隨時間的增加而降低，分別下降了48.4%、80.1%、64.2%、34.6%；鹽度2.5%泥蚶血漿TSOD活力呈先增后降趨勢，在2 d時增加至最大，后較1 d降低9.8%；鹽度3.0%泥蚶血漿TSOD活力較1 d時增加22.7%，對照組TSOD活力顯著高于鹽度0組，極顯著高于鹽度0.5%、1.0%組。

2.4　鹽度脅迫對泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影響

鹽度脅迫對泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影響如圖3所示，試驗過程中低鹽度各組呈現先降后增趨勢，對照組及中鹽度組呈降低趨勢。與試驗開始相比各組均有所降低，其中對照組由開始的(1.805±0.004) U·mg-1降至(0.465±0.099) U·mg-1，降低了74.2%。低鹽度組在試驗結束時分別為(0.562±0.126) U·mg-1、(0.737±0.059) U·mg-1、(0.659±0.130) U·mg-1，分別降低了68.9%、59.2%、63.5%。中鹽度組較開始分別降低了76.2%、81.8%。實驗結束時泥蚶組織NA+/K+-ATP酶活力呈現低鹽度組>對照組>中鹽度組。

圖3　　　　不同鹽度對泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影響

3　討論

泥蚶是變滲壓生物，沒有專門的滲透壓調解器官，環境因素尤其是生長環境的鹽度變化對泥蚶生長和生命活動有重要影響，當泥蚶生長環境的鹽度升高或降低幅度過大時會出現閉殼及進出水管收縮關閉，進而導致泥蚶攝食活動減少、生長速度減慢等。本次試驗中對照組及鹽度為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的實驗組在試驗結束前全部死亡，可能是由于泥蚶的滲透調節能力較弱，在鹽度高于1.5%條件下，滲透調節已經接近極限，超過此極限，泥蚶即大量死亡。研究表明，泥蚶在低鹽度的海水中死亡率顯著低于高鹽海水中的死亡率，對高鹽更敏感，這與尤仲杰等[9]在海水溫度鹽度對泥蚶稚貝生長及存活的影響的研究中結果一致。這可能是由于泥蚶棲息于海水鹽度較低且相對穩定的水域，長期的適應使泥蚶缺乏長期耐受高鹽的能力。

試驗發現，低鹽度的2個試驗組(0、0.5%)滲透壓值，隨時間的增加而降低且均低于對照組及其他試驗組，鹽度2.5%、3.0%、3.5%、4.0%處理在試驗1 d時滲透壓值明顯增加，且均顯著高于其他各組，這與蔡星媛等[4]在鹽度脅迫對魁蚶稚貝血液滲透壓影響的研究中結果一致，對照組較開始滲透壓值略有降低?？赡芤驗楫敪h境鹽度發生改變時，雙殼貝類會緊閉雙殼、關閉進出水管和外套腔來緩解高鹽或低鹽脅迫的壓力。試驗過程中也發現，泥蚶在鹽度脅迫時首先會關閉貝殼，隨后才逐漸緩慢開殼，隨著試驗時間的增加，低鹽脅迫下泥蚶閉殼時間相對較短，而鹽度2.5%、3.0%、3.5%、4.0%處理開、閉殼次數減少，頻率也減少，因此若長期處于高鹽脅迫環境中泥蚶的生長和存活均會受到一定影響。

鹽度脅迫下貝類滲透壓變化，隨之其生理活動發生變化，在這個過程中貝類體內酶的活力也發生變化[10-12]。POD是一種生物氧化中的末端氧化酶[13]，它廣泛存在于生物各個組織中，能催化分解過氧化氫從而起到保護生物體的作用。本次試驗表明，高鹽度組POD活力較開始顯著降低，低鹽度組較開始顯著增加。試驗結束時POD活力依次為低鹽度組>對照組> 高鹽度組，即POD活力與鹽度高低呈負相關。這與呂昊澤等[10]以及李子牛等[11]的研究結果相類似。表明鹽度脅迫時，泥蚶為適應環境通過增大POD活力來增強滲透壓適應能力，從而減少環境對機體造成的傷害。而當鹽度較大時，POD活力下降，可能是鹽度影響超過了泥蚶自身調節能力，因而在試驗過程中出現部分死亡現象。與POD活力相比TSOD活力開始時增加后降低趨勢更明顯，這與呂昊澤等[10]的研究結果相似，說明TSOD對鹽度脅迫更為敏感。

海洋無脊椎動物組織中Na+/K+-ATP酶在其應對環境中鹽度變化過程中發揮作用，Na+/K+-ATP酶活力與部分魚類、雙殼貝類等滲透壓的調節能力顯著相關。試驗結果表明，低鹽度各組呈現先降后增趨勢，對照組及高鹽度組呈現降低趨勢。實驗結束時泥蚶組織Na+/K+-ATP酶活力呈現低鹽度組>對照組>中鹽度組。這與林聽聽等[14]的研究結果不同，林聽聽等[14]的研究發現：在不同鹽度脅迫下青蛤鰓組織中Na+/K+-ATP酶活性在低鹽時增加，高鹽時下降?？赡苡捎谠囼瀸ο蠹霸囼烕}度脅迫方式不同，泥蚶較青蛤而言在鹽度脅迫下自身滲透壓的調節時間不同，并且本次試驗不是采取鹽度驟升或驟降的方式進行脅迫，使得結果略有差異。

4　小結

環境鹽度對離水貝類的存活影響較大，因而不同鹽度脅迫對泥蚶存活率的影響不同，在一定溫度的條件下合理降低貯藏鹽度能夠延長泥蚶的存活率。

通過不同鹽度對泥蚶3種酶活力高低比較，在試驗結束時泥蚶血漿中POD活力呈低鹽度組>對照組>中高鹽度組，血漿中TSOD活力和組織中Na+/K+-ATP酶活性均較開始有所下降。

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