面向人體暴露評價的植物中抗生素分析進展

楊曉靜，薛偉鋒，陳溪，田潤，喬顯亮,*

1. 大連理工大學環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，大連 100624 2. 大連出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，莊河116400

抗生素是一類對細菌、真菌、支原體、衣原體等致病微生物具有抑制或殺滅作用的天然、半合成或完全人工合成的藥物，按其化學結構可以分為磺胺類、喹諾酮類、四環素類、大環內酯類和β-內酰胺類等。抗生素因具有預防和治療疾病、促進生長的作用，被廣泛應用于人類和動物醫療和牲畜飼養業[1]。抗生素進入人體或動物體后僅有一小部分被吸收，約有10%～90%以原藥形式隨著動物糞便排放到環境中[2]。另外，抗生素在城市污水處理系統中，一般去除效果并不理想，導致部分抗生素隨出水或者污泥排放進入到環境中[3]。目前，已在土壤[4-6]、沉積物[6]和地表水[7-8]等多種環境介質中檢出抗生素。抗生素最受關注的生態環境效應是能夠導致抗性基因和抗性細菌的產生[9]。近些年，已經在土壤、沉積物和地表水中檢測到磺胺類、β-內酰胺類、四環素類、氯霉素和大環內酯類等多種抗生素的抗性基因[9-10]。目前，國內外一系列研究表明，很多農作物可以從土壤中吸收抗生素，會導致人體的低劑量被動暴露，引起較廣泛的關注和研究。

1　植物對土壤中抗生素的吸收(Uptake of antibiotics by plants from soils)

土壤是環境中抗生素重要的匯。在農業生產中，動物糞便和市政污泥被作為有機肥施用以及再生水灌溉，是抗生素進入土壤中的主要途徑[11-13]。我國是世界上抗生素生產和使用第一大國，據估計，僅2013年抗生素使用總量就達16.2萬噸，對于最常使用的36種抗生素，其隨動物和人體排泄的總量達5.4萬噸[14]。其中，畜禽糞便中不少抗生素濃度在mg·kg-1水平，一些區域的畜禽糞便中抗生素濃度高達幾十到幾百mg·kg-1[15-16]。我國不少區域的土壤中存在抗生素包括磺胺類、四環素類和喹諾酮類等檢出，其濃度在μg·kg-1至mg·kg-1(干重)水平[4-5, 17]。如Hu等[18]在施加畜禽糞便的土壤中，檢測出抗生素濃度為0.1～2.683 mg·kg-1。土壤是農業生產最重要的介質和載體。植物在土壤中除了吸收需要的養分，也會吸收共存的污染物。目前，國內外一系列研究表明，不少農作物可以從土壤中吸收抗生素。前人已考察了多種植物(如生菜、菠菜、芹菜、蘿卜、番茄和黃瓜等)對最常用的幾類抗生素(磺胺類、喹諾酮類、四環素類和大環內酯類)的吸收[18-22]。研究結果表明，植物吸收抗生素受植物種類、抗生素理化性質(如正辛醇水分配系數Kow和解離常數pKa等)、培養介質以及暴露濃度等多個因素的影響。

與疏水性化合物不同，大多數抗生素屬于可電離化合物，有2個或多個pKa值，使其在不同的pH條件下能夠以陰離子、陽離子或者兩性離子存在[21, 23]。不同形態的抗生素，其化學屬性差異很大，與生物膜的作用機制也存在差異，因此也會影響其植物吸收的過程[24-25]。表1中列舉了一些植物吸收抗生素的研究。一般實驗室模擬條件下抗生素的暴露水平較高，造成植物中抗生素濃度也較高。例如，Ahmed等[19]研究發現，磺胺類抗生素暴露濃度為20 mg·kg-1時，番茄根部中磺胺甲惡唑的積累濃度可達34 mg·kg-1。但是，在接近實際環境水平下對植物進行暴露，植物吸收抗生素的濃度水平一般較低，檢出水平為μg·kg-1[12, 18, 27]。Hu等[18]研究了畜禽養殖場糞便施加于土壤中，油菜、芹菜、香菜和胡蘿卜對11種抗生素的吸收，結果表明，植物中土霉素和四環素的濃度分別為76.8和79.3 μg·kg-1，其他抗生素濃度都小于10 μg·kg-1。我國既是農業大國，又是抗生素使用大國，農業生產中普遍將畜禽糞便作為有機肥使用到農田，使我國土壤中的抗生素污染問題非常嚴峻，植物吸收可能引起的抗生素人體暴露問題非常值得關注和研究。

2　植物中抗生素的分析方法 (Analytical procedure of antibiotics in plants)

為了評估抗生素在植物中的積累所引發的人類健康風險問題，建立植物樣品中抗生素的分析方法十分必要。植物樣品中抗生素的分析，與其他環境樣品如土壤[6, 28]、污泥[29]、沉積物[6]、糞便[28]和地表水[30]等的抗生素分析既相似，又存在一些區別。目前，關于植物樣品中抗生素的分析(見表2)，一些是專門針對抗生素構建的方法，還有一些方法旨在分析多種藥物和個人護理用品(Pharmaceutical and Personal Care Products, PPCPs)，其中涵蓋一些抗生素，這類方法的分析條件和參數并非針對抗生素確定和優化[35-36]。本文對目前植物樣品中抗生素的分析研究進行了綜述，結合植物樣品中抗生素的主要分析流程(見圖1)，重點介紹了樣品的提取、凈化和儀器分析等方面的研究進展。

2.1　樣品準備

植物樣品采集方式取決于實驗目的，可以整棵植株采集處理[18]，也可以將植株分成不同部位(如根、莖、葉和果實等)分別保存處理[11, 37]。用于分析的樣品可以選擇鮮樣或凍干。一些研究中選擇鮮樣，直接破碎或加入提取劑后破碎混勻，進行樣品前處理[26, 38]。對于短期內不能處理的樣品，多數采用真空冷凍干燥處理，然后研磨成粉[12, 37]，-4 ℃～-20 ℃條件下保存[11-12, 37]。

表1　植物吸收抗生素的研究Table 1　Studies of antibiotics accumulation in plants

注： a, ND，未檢出；b, 富集系數為植物組織中抗生素濃度與土壤中抗生素濃度比值；c, 該富集系數為植物組織中抗生素濃度與灌溉水中濃度比值。

Note: a, ND, not detected; b, Bioconcentration factor is the ratio of antibiotic concentration in plant tissue to the concentration in soils; c, Bioconcentration factor is the ratio of antibiotic concentration in plant tissue to the concentration in irrigation water.

圖1　植物中抗生素分析的一般流程Fig. 1　General procedure of antibiotics analysis in plants

2.2　樣品前處理

樣品前處理的目的是將待測組分從樣品基質中分離出來，以進行儀器分析。前處理的主要作用包括將目標化合物從樣品中提取出來、除去樣品中的干擾雜質、將待測組分轉換為可檢測的狀態、達到可檢測的濃度范圍和溶于可進行分析的溶劑。由于植物組織中葉綠素、油脂及蠟質等物質的存在可能導致嚴重的基質干擾，相對于從其他環境介質，從植物組織中提取分析抗生素具有更大的挑戰性。一般來說，植物樣品前處理過程主要包括以下內容：提取、凈化和濃縮。樣品前處理方法必須考慮待測組分的理化性質，樣品基質中主要的干擾物、處理方法對抗生素穩定性的影響與后續測定方法的銜接等因素。

2.2.1樣品提取

提取的目的是最大可能地將目標化合物從基質中分離出來，進入到提取劑溶液中，同時盡量避免或減少基質中干擾物質的提取。目前，國內外對植物樣品中抗生素的提取方法主要有超聲提取法、加速溶劑萃取法、QuEChERS法、振蕩萃取法和凍融裂解法等[18, 20, 32, 34-36, 39]。

多數抗生素的結構中包含極性較強的官能團，因此，常采用極性溶劑，如甲醇、乙腈、丙酮、水或幾種試劑的混合物等作為提取劑。Chuang等[32]比較了不同比例的乙腈、甲醇和水的混合物對植物中11種化合物(包括7種抗生素)的提取，結果表明，當三者比例為46:25:29時，所有目標化合物的回收率均在70%以上，相對標準偏差都小于20%。除了甲醇和乙腈被作為常用的提取劑，也有研究利用極性較大的丙酮作為提取劑，來提升提取效率[12, 18, 39]。不少抗生素含有堿性或酸性基團，有2個或2個以上pKa值，受環境pH影響可以呈現出不同的離子形態，當化合物處于不帶電狀態時，可以增加其進入到溶劑的幾率，因此在提取劑中常加入適量的酸(鹽酸或甲酸等)或鹽(麥氏緩沖鹽Mcllvaine等)以提高目標化合物的提取效率。Lillenberg等[40]分析污泥中7種抗生素(包含喹諾酮類、四環素類和磺胺類)，以甲醇、乙腈的水溶液作為提取劑時，多數抗生素的回收率較低，當在提取液中加入磷酸和檸檬酸后，提取效率有所提高。由于一些抗生素(如四環素類抗生素)可以與金屬離子螯合形成絡合物，在提取劑中需要添加絡合劑(如EDTA)等[41]。Chitescu等[35]采用超聲提取植物中抗生素時，發現提取劑中添加Na2EDTA后，之前未被檢出的土霉素、雙氯青霉素、紅霉素都被檢出。值得注意的是，在酸性條件下利用加速溶劑萃取提取目標化合物時，EDTA可能會析出并堵塞管路，可以采用檸檬酸或草酸等絡合劑代替[6, 35]。

目前，超聲提取法(Ultrasonic Liquid Extraction, ULE)和加速溶劑萃取法(Accelerated Solvent Extraction, ASE)是抗生素分析中應用較為廣泛的提取方法(見表2)。超聲提取法是利用超聲波振動來使樣品和溶劑充分接觸，具有萃取效率高、費時少和易操作的特點。如Hu等[18]利用超聲提取植物中抗生素，回收率均大于71%。提取液用量過少或提取時間較短，可能導致提取不完全，回收率偏低，而使用過多的提取液或提取時間過長，則可能導致提取的雜質較多，干擾大，影響抗生素回收率[42]。

加速溶劑萃取法，又稱加壓溶劑萃取法(Pressurized Liquid Extraction, PLE)，是通過高溫高壓條件提高化合物從固相樣品進入到有機溶劑中的提取方法，因其有機溶劑用量少，操作方便，快速且結果可重復性高等優點，被廣泛應用于環境樣品的提取分析。表2列舉了采用加速溶劑萃取法提取植物中抗生素的部分研究。采用加速溶劑萃取法提取植物中抗生素，可以通過調整提取參數，包括樣品量、提取劑組成、pH、溫度、壓力、時間、靜態萃取時間和循環次數等，提高目標物的回收率[6, 29, 35, 40]。一般情況下，升高溫度可以增加化合物在溶劑中的溶解，增加萃取時間也可以提高目標化合物的提取效率。然而，Chitescu等[35]發現過度的高溫和過長的提取時間會使樣品基質中的雜質更多地進入到提取液中，影響后續凈化或分離檢測。此外，高溫容易造成一些目標化合物的熱降解，從而影響提取效率[24, 29]。有研究在萃取池中加入一定的凈化材料如佛羅里硅土(Fluorosil)和氧化鋁等，在萃取同時進行樣品的凈化[20]。

振蕩提取法是早期提取植物中抗生素采用的方法，其原理是通過振蕩方式使樣品和溶劑充分接觸，增加目標化合物從樣品進入到提取劑的效率。Migliore等[39]先后以甲醇/鹽酸和丙酮為提取劑，手動振蕩提取了大麥中磺胺間二甲氧嘧啶，回收率大于80%。雖然振蕩提取操作簡單、易于實現，但是當提取多種目標化合物時，其效果不如超聲提取法或加速溶劑萃取法[43]。QuEChERS方法是一種新型的可用于有機物分析的前處理方法，因具有快速(Quick)、簡單(Easy)、廉價(Cheap)、有效(Effective)、耐用(Rugged)和安全(Safe)的特點而得名，其原理是在一些鹽分存在條件下，利用極性溶劑提取樣品中化合物，同時通過分散固相萃取(d-SPE)對樣品進行凈化，是一種集提取凈化于一體的分析方法。QuEChERS方法主要被應用在提取農作物產品中的農藥殘留分析，近年來經改進后被應用于環境樣品(如動物[44]、土壤[45]以及植物[32])中的抗生素檢測。Chuang等[32]應用QuEChERS方法對芹菜中的11種化合物(包含7種抗生素)進行提取，加標濃度為200 μg·kg-1時，回收率為70.1%～118.6%。凍融細胞裂解法(Freeze-and-thaw Cell Lysing)是對新鮮樣品進行冷凍和溶解，使植物細胞破裂，釋放出內含物的提取方法。Sallach等[34]利用凍融細胞裂解法，以異丙醇/緩沖溶液作為提取液，提取生菜中的林可霉素、環丙沙星、土霉素和磺胺甲惡唑4種抗生素，其回收率為43%～139%。

2.2.2凈化與濃縮

植物組織中含有大量的葉綠素、油脂和蠟質材料等，可以隨著目標化合物被提取劑所提取，繼而影響后續檢測分析，甚至會影響儀器的運行[20, 24]。對提取液進行凈化，不僅能夠減少基質效應，提高檢測靈敏度，保證較高回收率，也能延長色譜柱壽命。目前，常用的凈化方法有固相萃取技術(Solid Phase Extraction, SPE)和液液萃取技術(Liquid Liquid Extraction, LLE)等。

SPE是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，使樣品的基質和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達到分離和富集目標化合物的目的。該方法大大增強了對分析物的檢出能力，提高了被測樣品的回收率。SPE最初被應用于水中污染物的濃縮[30]，后來逐漸應用于固體樣品如污泥[40]、糞便[28]、土壤[28]和植物[12, 18, 26]中抗生素的凈化，是目前抗生素分析中最廣泛的凈化技術[46]。親水親脂平衡柱(Hydrophilic Lipophilic Balanced, HLB)的填料為N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯的共聚物，是目前應用較廣的固相萃取柱，對親水和疏水化合物都有較強的保留能力，可以在較寬的pH范圍內萃取酸性、中性和堿性目標物[46]。由于pH可以影響抗生素的電離形態，從而影響抗生素在SPE柱上的保留，因此，通過調節樣品溶液的pH，可以提高富集凈化能力[6, 40]。目標化合物與吸附劑接觸的時間對富集凈化有重要影響。流速過快容易使目標化合物與吸附劑接觸不充分而造成損失，多數研究中進樣速度控制在1～3 mL·min-1[19, 31, 33]。抗生素分析中多采用甲醇作為SPE的洗脫劑，用量一般為2.5～10 mL[12, 19, 26]。

表2　植物中抗生素的分析檢測方法Table 2　Analytical methods of antibiotics in plant tissues

注：表格中所列研究都是利用LC-MS/MS檢測。LOD為檢出限，LOQ為定量限。

Note: All the studies listed in this table are the results using LC-MS/MS. LOD stands for limit of detection; LOQ stands for limit of quantitation.

LLE是利用化合物在不相溶的溶劑中溶解度的不同，使目標化合物從溶解度低的溶劑中進入到高溶解度溶劑中的凈化方法。前人研究中以己烷作溶劑，利用LLE方法去除疏水性雜質[20, 39]。但是，當分析中包含疏水性的目標物時，該方法需謹慎使用。QuEChERS方法中可以利用分散固相萃取(d-SPE)對提取物進行凈化，N-丙基二乙胺(Primary Secondary Amine, PSA)是較常用的吸附劑，同時也可以利用C18和石墨化炭黑(GCB)等作為進一步的凈化材料[32, 47]。Chuang等[32]利用QuEChERS方法，提取生菜和芹菜中的11種PPCPs時以d-SPE(其中，C18: 12.5 mg；PSA: 12.5 mg和Na2SO4: 225 mg)對提取液進行了凈化。另外，加速溶劑萃取過程中，在萃取池中加入適當的吸附劑(如佛羅里硅土和氧化鋁等)，也可以在一定程度上實現樣品的凈化[20]。

抗生素分析中常用的濃縮方法為氮氣吹掃和旋轉蒸發(見表2)[12, 18, 20, 26]。氮氣吹掃利用氮氣流將溶劑帶出，一般在低溫加熱條件下進行，該方法多用于少量液體的濃縮。旋轉蒸發的濃縮速度相對較快，且溶劑可回收。

2.3　儀器分析

目前，對植物中抗生素的分析檢測方法有液相色譜串聯質譜聯用(HPLC-MSn)、酶聯免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、液相色譜-紫外/二極管陣列檢測器(HPLC-UV/DAD)和液相色譜-熒光檢測器(HPLC-FLD)。HPLC-UV/DAD或HPLC-FLD是較早用來分離檢測抗生素的方法[39, 48-49]。由于基質效應的存在，紫外或熒光檢測有時會受到嚴重的干擾，而且靈敏度也不高，目前已經逐漸被HPLC-MSn所替代[50]。ELISA是把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理有機地結合起來的一種經濟、快速檢測技術，在植物中抗生素的檢測也有應用[27, 51-52]。盡管ELISA對特定抗生素的檢測可以實現快速篩查，但是由于其提取劑較溫和，會影響抗生素的提取效率和分析的準確性[13, 46]。近年來，高效液相色譜-串聯質譜聯用(LC-MSn)技術發展迅速，因其靈敏度高、選擇性強等優點逐漸成為檢測環境基質中目標化合物的主流方法。基于三重四級桿的分析質譜(QqQ)是目前分析環境中抗生素應用最廣泛的檢測儀器，其具有較高的靈敏度、選擇性和特異性，多反應檢測(MRM)模式有效降低了分析中的干擾，為痕量分析提供了較好的選擇性。

在抗生素分析中，C18柱是較常用的色譜柱[18, 26, 33]，選擇的流動相一般為甲醇或乙腈的有機相以及緩沖體系的水相兩類，在流動相中加酸(如甲酸、乙酸等)，可以改善色譜柱的分析和離子化效應[28]。進樣溶劑也會影響色譜峰形。Ho等[28]分析9種抗生素時，比較了幾種溶劑對色譜峰的影響，發現初始流動相作為溶劑時，分析物目標峰形較好。

抗生素分析中電噴霧離子化(ESI)是最常用的離子化方式，ESI易受到樣品基質的干擾，導致目標化合物信號抑制或增強，從而影響檢測結果的準確性，其中正離子模式一般比負離子模式表現出更強的基質效應[20, 43]。Wu等[36]在分析生菜中的19種PPCPs時發現，植物基質顯著抑制對乙酰氨基酚(acetaminophen)的分析信號，使其無法準確分析；同時還發現，甲氧芐氨嘧啶在芹菜中回收率為50.6%，而在番茄中回收率僅有17.9%，說明對于同一目標物不同植物的基質效應差別很大。對于不同的目標化合物，植物的基質效應也不同。Jones-lepp等[20]采用加速溶劑萃取法從生菜等蔬菜中提取克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素和克林霉素時，由于樣品的基質效應，目標物的回收率差異顯著(2%～76%)。

對于環境樣品的基質效應，一般無法徹底去除，但可以采取一些方法或措施來減小或校正。有效的樣品凈化措施，如固相萃取、液液萃取等，可以從樣品中去除一部分的雜質，一定程度上減少基質效應[18, 20, 36]。其次，基質匹配法也可以校正基質干擾，即利用與樣品基質成分盡可能一致的溶液配制標準曲線，從而校準基質效應帶來的誤差[53]。內標法也是校準基質效應較為有效的措施。Wu等[36]在分析7種蔬菜中PPCPs時，采用與目標物對應的氘代化合物作為回收率替代物，校正前回收率為2.5%～107.9%，校正后的回收率提升為56.3%～129.6%。同位素標記試劑價格昂貴，且并不是所有化合物都有相對應的標記試劑，因此在多數實驗中都是采用一種或幾種標記試劑作為回收率指示劑[11, 38]。Herklotz等[38]在分析卷心菜等蔬菜中的PPCPs時，通過在樣品中同時添加13C和15N標記的卡馬西平和目標物標樣對基質效應進行校正，回收率可提升到>70%。

高分辨質譜主要包括飛行時間質譜(TOF)、四級桿-飛行時間質譜串聯儀(Q-TOF)和軌道離子阱質譜(Orbitrap)等，因其可提供母離子和大量的多級碎片離子的精確質量以供結構鑒定，從而實現復雜基質中目標物的定性和定量。目前，高分辨質譜已經成功應用于環境樣品中抗生素及其代謝產物的測定，如Hoff等[54]利用Orbitrap分離和鑒定了動物組織中磺胺喹喔啉的代謝產物。Perez-Parada等[55]利用Q-TOF鑒定了廢水和地表水中阿莫西林及其代謝產物。前人研究表明，植物可以吸收抗生素的代謝產物或者被吸收的抗生素在植物體內可以代謝[56-57]。采用高分辨質譜對植物樣品中抗生素代謝產物的定性和定量，可以更全面地評價抗生素對人體的暴露風險。

3　展望 (Prospect)

關于植物吸收抗生素的研究中，多數是在土壤中添加一定量抗生素標準品，或灌溉含有抗生素的再生水，或向土壤中施加含有抗生素的生物固體等，而關于實際農業生產條件下植物吸收抗生素的研究較少。今后的研究應該更關注田間實際生產條件下植物對抗生素的吸收研究，以更準確地評估抗生素通過食物鏈對人體的暴露風險。

從已有的研究可以看出，植物可以從培養基質中吸收包括磺胺類、喹諾酮類、四環素類、氯霉素類、β-內酰胺類和大環內酯類等多類抗生素。但目前關于植物中抗生素的分析方法中，包含抗生素的種類偏少，如一些方法中，僅選擇性地包含了幾種或者幾類抗生素，方法的適用面較窄[32, 35-36]。另外，已有研究表明，田間條件下植物對抗生素的吸收濃度較低，一般為μg·kg-1水平。在開發植物中抗生素的分析方法時，需要在實際環境樣品濃度水平下，開發包括多類抗生素的綜合方法，以提高分析的效率和準確性。

當研究的目標物同時包含一些非離子型PPCPs類化合物時，要綜合考慮化合物結構和理化性質的差異，針對目標物的性質來選擇合適的提取劑和提取方法，有時可以采取多種提取劑分步組合的方法，來提高目標化合物的提取效率。雖然HLB是目前采用較多的固相萃取柱，考慮到PPCPs化合物結構和性質的廣泛性，以及植物樣品包含較多色素等物質的特點，需要進一步開發新型的凈化材料和固相萃取柱，以更好的支撐植物樣品的分析。

抗生素及PPCPs在植物體內可以被代謝生成產物，以往的分析方法中對代謝產物的檢測分析研究較少。為了全面、準確地評估人類通過食物攝食的暴露風險，需要加強對抗生素及PPCPs代謝產物的研究。高分辨質譜分析技術的發展為分析植物中化合物的代謝產物提供了技術支撐，需要進一步開發相應的分析方法。

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